前言

蓝莓的深蓝色泽源自一类关键分子——花色素糖。这些天然色素不仅是植物界的“调色师”，更因其抗氧化、抗炎等健康功能，成为功能性食品与药物开发的明星分子。然而，决定这些糖苷分子最终结构与功能的，是一类看不见的“糖艺工匠”——糖基转移酶（UGTs）。

浙江大学陈卫教授团队在《Science Advances》上发表的研究，从蓝莓中发现了一种特殊的糖基转移酶UGT75AJ2。该酶天然具备罕见的3′-O与7-O双位点糖基化能力，对合成稀有花色素糖苷及天然蓝色色素极具价值。有趣的是，尽管在系统进化上属于5-O-糖基转移酶簇，实验证实它主要催化3′-OH和7-OH位点。这种功能与分类的“错位”，暗示了其催化逻辑的特殊性。

研究者由此提出一个关键问题：能否解读这种“反常逻辑”，进而实现糖基化的可控设计与编程？然而，这位天然“工匠”存在三大短板：活性极低、糖供体单一（仅识别UDP-Glc）、区域选择性差，使其难以实际应用。这些难题也是整个UGT酶家族面临的共同挑战。传统酶改造方法如同“大海捞针”，效率低下且易陷入局部最优。根本无法满足系统解读并重塑酶功能的高精度要求。

研究团队给出的答案是——FRISM（Focused Rational Iterative Site-specific Mutagenesis）策略。这并非简单的“结构辅助改造”，而是一个将结构预测、能量分析与迭代优化深度融合的可复现工程闭环，旨在系统性地解读并重塑酶的催化逻辑。

研究团队首先通过多重结构建模与分子对接，锁定酶活性口袋附近约70个潜在关键位点。随后，他们对这些位点进行虚拟饱和突变，并通过结合自由能变化（ΔΔG_mut）计算与严格的统计学分析（FDR < 0.05），筛选出那些会“扰动”酶结构的不稳定残基（ΔΔG_mut > 0）。再结合进化保守性分析排除不可变的功能位点，最终精准锚定了34个位于糖供体与受体通道的关键残基，作为核心突变热点。

与传统理性设计追求“增强结合”（ΔΔG_mut < 0）的思路相反，本研究创新性地重点关注那些会“削弱”结合的突变（ΔΔG_mut > 0）。其核心逻辑在于：适度的“受控扰动”可迫使底物在口袋中调整构象，从而更有可能进入一个利于催化的“过渡态”，而非被过于稳定地“锁死”在非生产性结合模式中。这一反直觉策略，为后续实现催化效率的飞跃奠定了理论基础。

第二步：“迭代进化”：四轮优化，活性飙升128倍

在确定了突变靶点后，FRISM的第二步采用分轮、逐步优化的方式。团队将能量热点分为数个功能模块，从单突变开始，逐轮筛选性能提升最显著的组合。在四轮迭代后，他们构建出四突变体 Mut4-1（S367A/V274A/F82V/I132T）：转化率由野生型的0.17%提升至22.4%；催化效率（kcat/Km）提高73倍；整体酶活提升达 128倍。

早在2020年，该研究团队关注到这一问题，以甜杏仁（Prunus communis）来源的FAD依赖型PcHNL5出发，解析其与天然底物苯甲醛的复合物晶体结构，对底物隧道中的氨基酸进行理性突变，发现L331A单点突变能拓宽酶的底物通道，使其能够处理体积较大的1,3-二氧六环并苯甲醛（1d）等非天然底物。但突变体PcHNL5_L331A的催化效率仅为 1.8 s⁻¹·mM⁻¹，远低于野生型PcHNL5对苯甲醛的 76 s⁻¹·mM⁻¹。

UGT类酶长期存在一个顽疾：它们几乎只接受UDP-Glc这一种糖供体，应用范围极其受限。研究团队通过对糖供体结合口袋的电荷与氢键网络分析，发现残基 F366 和 S367 在供体识别中起到“闸门”作用。于是，他们设了 S14G/F366H/S367G 三突变体，通过空间重塑让口袋更大、更柔性，同时保持催化位点稳定。改造后的酶成功打破了天然局限，能够同时高效利用 UDP-Glc、UDP-Gal、UDP-Xyl、UDP-GlcNAc 四种糖供体，实现了从单糖型到多糖型的跨越。

不仅如此，团队进一步证明，通过改变I132与S367等位点的空间取向，可以控制糖基在黄酮分子的不同羟基位点进行转移：I132E优先在 3′-O 位点糖基化；S367W选择性 7-O 位点；S367F可实现罕见的 5-O 位点修饰。通过组合优化，他们进一步获得了Y75E/F185Y/I132T 和 L112F/M273E/S367D 两个高性能三突变体，分别实现了对3′-O位点高达99%的选择性（93%转化率）和对7-O位点85%的选择性（80%转化率），将“可控可设计”推向了极致。

本研究构建的FRISM策略，通过精准热点识别和独特的“能量扰动”设计思想，实现了从盲目筛选到理性设计的跨越。

该策略不仅成功将UGT75AJ2的活性提升128倍，更一举突破了糖供体限制和区域选择性控制难题，为糖基转移酶的定向改造提供了标准化解决方案。这项研究为天然产物绿色制造和药物研发提供了强大的工具，也为实现智能化酶设计奠定了坚实基础。

作者：陈勤

编辑排版丨品牌

审核丨市场部、研发中

图片丨来源于瀚海新酶、网络（侵删）

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