新闻中心
NEWS CENTER

EBC新品发布 | 见微知著,让DNases & RNases无所遁形

来源:瀚海生物市场中心 时间:2022-10-28 作者:瀚海新酶 浏览量:134

近年来,mRNA合成技术的应用越来越广泛,对mRNA疫苗、药物研究和生产过程中质量控制的要求也在不断提高。脱氧核糖核酸酶(DNases)和核糖核酸酶(RNases)是普遍存在于环境和许多生物材料中的一类酶。它们可以降解DNA或RNA,对许多涉及DNA及RNA的研究和生产过程造成影响。由于mRNA分子的脆弱性,抑制或消除研究、生产环境中的核酸酶活性显得极为重要。

对于研发与生产环境以及原料中的DNases与RNases残留,由于其含量处于一个未知状态,检测其存在的方法是否有足够的灵敏度成为一个难题;同时还要考虑到检测的时效性,不能影响相关研发与生产进度。

为此,我们需要一种快速、灵敏的方法来检测环境(如实验台面,移液器吸头、储液袋、反应器等耗材)及物料(如抗体、酶、缓冲液)中的核酸酶活性,判定是否存在DNases或RNases污染,同时能够定量评估污染的程度,从而制定相应的清除方案以达到研发与生产条件的需求。

界定无污染的方法,在《USP43》、《EP10》及《中国药典2020版》等文件中尚无明确规定。核酸水解-紫外分光光度法定量限仅为0.01U/μL,不适合微量核酸酶的活性检测。核酸水解-凝胶电泳法受实验人员的主观判断影响较大,无法准确定量,另外操作时间长也降低了测定通量。高效液相色谱(HPLC)及电化学法等,则耗时费力,且受限于仪器设备。

对此,有研究人员[1]提出了荧光探针法,不仅灵敏度高、检测速度快,且能实现核酸酶活性的定量检测。而DNase/RNase荧光探针法检测试剂盒正是最佳选择之一。

瀚海新酶经过反复摸索与不断优化,推出HS-DNase检测试剂盒(荧光探针法)与HS-RNase检测试剂盒(荧光探针法),全面满足DNases与RNases检测中的高灵敏度与时效性问题。

该高灵敏度检测试剂盒为国内首次推出!

检测原理:

DNase和RNase检测试剂盒的原理相同。

设计出标记有荧光基团的DNA探针和RNA探针,与测试样本混合。

当样本中不含DNases或RNases活性时,该探针稳定存在,荧光基团和淬灭基团距离较近,由于荧光共振能量转移原理,不会产生荧光信号;

当样本中含有DNases或RNases活性时,探针被降解,荧光基团和淬灭基团相互远离,从而产生逐渐增强的荧光信号;

荧光增加的速率与酶的数量和活性成正相关。

原理如下图所示:

EBC新品发布 | 见微知著,让DNases & RNases无所遁形插图

荧光探针法原理示意图

EBC新品发布 | 见微知著,让DNases & RNases无所遁形插图1

DNase/RNase检测试剂盒反应曲线示意图

产品展示:

EBC新品发布 | 见微知著,让DNases & RNases无所遁形插图2

HS-DNase检测试剂盒(荧光探针法)

适用范围:

用于检测科研和生产过程中环境、物料等的DNase污染情况

产品特点:

灵敏度高:检出限低至1.25×10-6U/μL(DNase I),为现有检测方法1/8

时效性高:反应30分钟即刻获得检测结果

灵敏度优于凝胶电泳法

HS-DNase检测试剂盒与核酸水解-凝胶电泳法对比,测定相同的低浓度酶样本,如图所示。

EBC新品发布 | 见微知著,让DNases & RNases无所遁形插图3

HS-DNase检测试剂盒测定3×10-5U/μL DNase I,与0浓度可明显区分

EBC新品发布 | 见微知著,让DNases & RNases无所遁形插图4

电泳法测定DNase I,9/10通道(3×10-5U/μL)与1~8通道(≤3×10-6U/μL)、17通道阴性对照不能明显区分。

灵敏度优于同类荧光探针法

与同类型方法(荧光探针法)相比,HS-DNase检测试剂盒检测下限低至其1/8

EBC新品发布 | 见微知著,让DNases & RNases无所遁形插图5

样本浓度为6.25×10-6U/μL时,同类型方法DNase检测试剂盒与阴性对照区分不明显

EBC新品发布 | 见微知著,让DNases & RNases无所遁形插图6

样本浓度为6.25×10-6U/μL时,HS-DNase检测试剂盒与阴性对照可明显区分

EBC新品发布 | 见微知著,让DNases & RNases无所遁形插图7

低浓度DNase I(1×10-6~10×10-6U/μL)时,同类型方法DNase检测试剂盒测出的S/N值接近1,HS-Dnase检测试剂盒呈倍数增加

HS-DNase检测试剂盒主要组成:

EBC新品发布 | 见微知著,让DNases & RNases无所遁形插图8

HS-DNase检测试剂盒组分

注:标准品为DNase I,其活性单位定义为:在DNase I反应缓冲液中,37℃条件下10分钟内能够完全降解1µg pBR322 DNA所需的酶量[1],一个DNase I活性单位相当于0.3 Kunitz单位[2]。

Q&A

HS-DNase检测试剂盒的反应温度和时间是怎样的?

请将反应体系置于37℃恒温条件下进行实验,反应时间为30分钟。

什么情况下可能出现假阳性或假阴性结果或定量结果不准确?

a.凝胶缓冲液、高浓度的粘性物质、表面活性剂和深色溶液可能干扰荧光基团发光;

b.如果待测样本溶液中含有抑制DNA酶活性的物质,则测定结果为样本溶液的整体酶活性,而不是其中的酶的活性。这些物质包括:

•高离子强度溶液(如5M NaCl、20x SSC、3M乙酸钠等)

•pH<4或pH>9的缓冲液

•离液剂、洗涤剂、螯合剂或任何使蛋白质变性的溶液(如SDS、硫氰酸胍、尿素、EDTA等)

c.引起DNA探针化学性质不稳定性的溶液,如pH>9的溶液、苛性溶液(强酸强碱、漂白剂等)。

制备标准品溶液时,前面的步骤为什么要用标准品稀释液稀释而不是用无DNase无RNase水稀释?

因为标准品在标准品稀释液中比较稳定,即使多次稀释也不会改变它本身的活性。如果用水稀释,多步操作可能会造成标准品的活性改变,标准曲线产生偏差。

如何调节合适的酶标仪增益值?

如您的酶标仪有自动增益选项,则选用自动增益。如您的酶标仪没有自动增益选项,则根据增益值范围先设置中间值,然后根据反应后阳性对照孔(79μL无DNase无RNase水+1μL DNase I标准品)的荧光值来调节合适的增益值:如超过仪器上限,则适当降低增益值,如远低于仪器上限,则适当调高增益值。

为什么严重污染的样本可能会出现假阴性的结果?

判定DNase污染的标准是:RFU30(待测样本)≥2×RFU0(待测样本),即反应30分钟时的RFU值达到0分钟的RFU值的2倍以上。如果样本被严重污染,则有可能反应开始时速度很快,在非常短的时间测到一个很高的RFU0值,出现RFU30(待测样本)<2×RFU0(待测样本)的假阴性结果。此时需要用无DNase无RNase水来稀释待测样本。

阴性对照的RFU值不为0,就说明阴性对照被污染了吗?

不一定。阴性对照通常也能够测到较低的RFU值,但不会随着反应时间的延长值显著增加,一般认为30分钟的RFU30小于0分钟的RFU0的2倍就说明阴性对照没有被污染。

产品信息:

EBC新品发布 | 见微知著,让DNases & RNases无所遁形插图9

RNase检测试剂盒(荧光探针法)

适用范围:

用于检测科研和生产过程中环境、物料等的RNase污染情况。

产品特点:

灵敏度高:检出限低至RNase A:0.313pg/mL,约1.56×10-9U/μL,为同类型方法检测试剂盒的1/8

时效性高:反应30分钟即刻获得检测结果

灵敏度优于凝胶电泳法

HS-RNase检测试剂盒与核酸水解-凝胶电泳法对比,测定相同的低浓度酶样本,如图所示。

EBC新品发布 | 见微知著,让DNases & RNases无所遁形插图10

HS-RNase检测试剂盒测定RNase A,2.5×10-8U/μL与0浓度可明显区分。

EBC新品发布 | 见微知著,让DNases & RNases无所遁形插图11

电泳法测定RNase A,1~8通道(5×10-8U/μL)与17、18通道(2.5×10-8U/μL)、19通道阴性对照无法区分。

灵敏度优于同类型检测方法

与同类型检测方法(荧光探针法)相比,HS-RNase检测试剂盒检测下限低至其1/8

EBC新品发布 | 见微知著,让DNases & RNases无所遁形插图12

样本浓度为3.13×10-9U/μL时,同类型方法RNase检测试剂盒与阴性对照区分不明显

EBC新品发布 | 见微知著,让DNases & RNases无所遁形插图13

样本浓度为3.13×10-9U/μL时,HS-RNase检测试剂盒与阴性对照可明显区分

EBC新品发布 | 见微知著,让DNases & RNases无所遁形插图14

低浓度RNase A(1×10-6~10×10-6U/μL)时,

同类型检测方法RNase检测试剂盒测出的S/N值为1-2之间,HS-RNase检测试剂盒呈倍数增加。

HS-RNase检测试剂盒主要组成:

EBC新品发布 | 见微知著,让DNases & RNases无所遁形插图15

注:标准品为RNase A,其活性单位定义为:酵母RNA在pH5.0和37℃条件下,260nm处的吸光度增加1.0对应的酶量[3],50个RNase A活性单位相当于1个Kunitz单位[4]。

Q&A

HH RNase检测试剂盒的反应温度和时间是怎样的?

请将反应体系置于37℃恒温条件下进行实验,反应时间为30分钟。

什么情况下可能出现假阳性或假阴性结果或定量结果不准确?

a.存在可能干扰荧光基团发光的物质,可能导致假阴性结果;

b.如果待测样本溶液中含有抑制RNA酶活性的物质,可能导致假阴性结果

c.引起RNA探针化学性质不稳定性的溶液,可能导致假阳性或假阴性结果

制备标准品溶液时,前面的步骤为什么要用标准品稀释液稀释而不是用无DNase无RNase水稀释?

因为标准品在标准品稀释液中比较稳定,即使多次稀释也不会改变它本身的活性。如果用水稀释,多步操作可能会造成标准品的活性改变,标准曲线产生偏差。

如何调节合适的酶标仪增益值?

如您的酶标仪有自动增益选项,则选用自动增益。如您的酶标仪没有自动增益选项,则根据增益值范围先设置中间值,然后根据反应后阳性对照孔(79μL无DNase无RNase水+1μL RNase A标准品)的荧光值来调节合适的增益值:如超过仪器上限,则适当降低增益值,如远低于仪器上限,则适当调高增益值。

为什么严重污染的样本可能会出现假阴性的结果?

判定RNase污染的标准是:RFU30(待测样本)≥2×RFU0(待测样本),即反应30分钟时的RFU值达到0分钟的RFU值的2倍以上。如果样本被严重污染,则有可能反应开始时速度很快,在非常短的时间测到一个很高的RFU0值,出现RFU30(待测样本)<2×RFU0(待测样本)的假阴性结果。此时需要用无DNase无RNase水来稀释待测样本。

阴性对照RFU值不为0,就说明阴性对照被污染了吗?

不一定。阴性对照通常也能够测到较低的RFU值,但不会随着反应时间的延长而RFU值显著增加,一般认为30分钟的RFU30小于0分钟的RFU0的2倍就说明阴性对照没有被污染。

产品信息

EBC新品发布 | 见微知著,让DNases & RNases无所遁形插图16

创新为要
CREATIVITY
追求卓越
EXCELLENCE
勇于担当
RESPONSIBILITY
合作共赢
COOPERATION
产品对比
产品信息
暂无产品
暂无产品
暂无产品
暂无产品
售价
基本参数
CAS
分子式
纯度
货号
货期
规格
姓名

*

公司

*

手机

*

手机

留言

扫描二维码,联系客服
获得产品报价