喜报！瀚海新酶开发出高通量、实时快速体外转录体系筛选系统

来源：瀚海生物市场中心时间：2022-11-30 作者：瀚海新酶浏览量：841

信息速递：体外转录（invitrotranscription,IVT）是指以线性DNA为模板，利用RNA聚合酶、NTP、缓冲体系为原料，酶促合成RNA的技术，是mRNA药物核心组分mRNA分子合成的关键步骤。目前阶段，mRNA药物相关工艺成熟度仍然较低，CMC仍然存在较大挑战。IVT体系优化是CMC过程中的关键环节之一，现有的基于IVT终产物的分析主要依赖于凝胶电泳、毛细管电泳或HPLC，方法耗时、耗力，且无法实时分析体外转录体系，大大限制了体外转录工艺优化效率。因此建立一种精准快速的IVT体系筛选方法将有助于促进mRNA药物相关技术的进步。

2022年11月14日，生物医药和体外诊断核心原料供应商瀚海新酶生物科技有限公司（以下简称“瀚海新酶”）宣布，与上海交通大学杨广宇教授团队合作开发了一套高通量、简单、灵敏的RNA合成监测和定量系统。研究团队通过筛选荧光适配体，建立了基于核酸适配体的IVT体系实时监测系统，可快速进行IVT条件、T7RNA聚合酶活力、启动子、UTR等筛选，为IVT系统化高通量评价与优化提供了更有效的工具。该项研究成果已于2022年10月27日正式在BioresourcesandBioprocessing（以下简称“BIBO”）杂志上发表，被BIBO评为11月推荐文章，该项技术已经申请专利。

瀚海新酶实时快速体外转录体系筛选系统：STAR系统助力mRNA药物研发

新冠病毒COVID-19疫情爆发以来，mRNA疫苗以其在医学领域掀起的巨大变革而荣登2021年《麻省理工科技评论》的“全球十大突破性技术”榜首。由于mRNA药物生产简易、成本低，极大地缩短和降低了新药开发的周期和成本，因此被许多专家认为有可能成为重组蛋白药物、单抗药物之后的生物药第三次浪潮，将对产业和医药领域产生巨大的影响。

体外转录（invitrotranscription,IVT）是mRNA药物合成中的重要技术，对体外转录进行分析对于RNA聚合酶的筛选、启动子的优化、新的抑制转录药物的筛选等方面均具有重要用途。然而，传统的凝胶电泳是实验室分析全长mRNA转录产物的主流方法，只有在IVT完成后才能使用荧光染料或放射性同位素分析RNA的产量和纯度。一些转录副产物，比如流产片段、dsRNA或截短RNA等产物，会导致弥散条带的产生，从而影响结果判定。HPLC和毛细管电泳为RNA分析提供了更准确的定量工具，但是这些方法耗时、耗力，且无法实时分析转录产物的情况。因此建立一种高通量、快速、准确的IVT体系筛选方法，将极大地促进mRNA药物相关技术的进步。

在本研究中，团队开发了一套基于iSpinach适配体的高通量、实时转录活性监测系统，命名为“iSpinachaptamer-basedmonitoringofTranscriptionActivityinReal-time(STAR)”。与基于凝胶电泳的方法相比，二者对体外RNA合成反应的分析结果表现出较高的一致性，但STAR系统的检测速度至少比传统PAGE方法快100倍；STAR系统还可以作为一种快速定量分析T7RNA聚合酶催化活性的方法。

该团队首先设计一段含有荧光适配体编码序列的体外转录DNA模板。在该情况下，只有全长产物并具有正确折叠构象才能与体系中的荧光原结合，产生荧光信号，而转录产物中的流产片段、截短片段等副产物不能产生荧光信号，从而真实的反映该IVT体系中全长产物的生成情况。通过实时检测体系荧光信号强度，获得了一种信噪比更高，更适合于IVT体外转录体系的iSpinach荧光适配体。（图1）

图1. 体外转录体系荧光适配体筛选

为了进一步验证STAR系统荧光适配体筛选结果，该团队采用传统的变性PAGE法和质谱法，对iSpinach转录产物进行分析。结果显示，除iSpinach目的片段外（72nt），该反应还产生两种3’端延伸度副产物（76nt和85nt）,这两种副产物也会产生荧光信号。这一结果符合预期，根据文献报道，T7RNA聚合酶具有较弱的RNA依赖性RNA聚合酶活性；同时根据文献报道，3’端延伸度副产物在RNA总产量中占比不超过10%，因此对STAR系统影响有限。

图2. iSpinach转录本PAGE和质谱分析结果

随后，作者采用STAR系统，对iSpinach模板的体外转录体系进行优化，具体对NTPs，MgCl2，单价离子，T7RNA聚合酶用量，反应温度，pH几种关键工艺参数分别进行了优化，确定了iSpinachDNA模板的最适反应体系，与聚丙烯酰胺凝胶电泳进行比较，结果均具有较好的一致性。（图3-4）

图3. 分析NTPs、MgCl2浓度对STAR系统的影响

图4. 分析温度、pH, 单价离子对STAR系统的影响

根据文献报道，T7RNA聚合酶的催化活性不仅影响体外转录产量，也影响RNA合成速度。传统方法采用同位素标记检测T7RNA聚合酶活性，该方法易产生放射性污染、且成本较高、不适合T7RNA聚合酶活性的高通量筛选。因此建立一种经济有效、无放射性、高通量的T7RNA聚合酶活性检测方法具有重要意义。采用STAR系统即可实时监测不同浓度的T7RNA聚合酶的活性，为酶活的快速表征提供了新方法。（图5）

图5. SATR系统应用案例：实时监测不同浓度T7 RNA聚合酶活性

转录起始是IVT反应的关键限速步骤，8-10bp的转录起始序列（ITS）对转录起始复合物的稳定性有较大影响，不合适的ITS序列会导致T7RNA聚合酶从DNA模板脱落，产生2-10nt的流产片段，因此对转录产量、完整性具有较大影响。因此对ITS序列的设计对RNA合成具有重要意义。

本研究中，作者采用STAR系统对GFP基因+1至+8位的转录起始序列ITS进行突变。结果发现，转录起始的两个G碱基对T7启动至关重要（图6）。将单点突变显示的能增强T7RNA聚合酶活性的GFP基因ITS位点进行合并突变，并用STAR系统进行分析。最终，3T4T突变体成功使T7RNA聚合酶转录效率提高50%。该案例表明STAR系统是一种可靠的、可以用于快速优化5′-UTR序列的方法。以上结果充分验证了STAR体系的应用潜力。目前该技术已经申请专利。（图6）；