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肌酸脒基水解酶CR

英文名称：CR

CAS：37340-58-2

货号：HH0202-01

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中文：肌酸脒基水解酶CR

英文：CR

CAS：37340-58-2

分子式：48 kDa(SDS-PAGE)

纯度：≥90%

货期：24h

货号：HH0202-01

规格：5ku

中文同义词：肌酸酶;肌氨酸酶;肌酸脱水酶;

英文同义词：Creatine Amidinohydrolase, CR,

技术指标

外观：白色无定型冻干粉末；蛋白纯度：≥90%；比活性：≥4 U/mg酶粉；过氧化氢酶：≤0.03%；肌酐酶：≤0.01%；肌氨酸氧化酶：≤0.01%；NADH氧化酶：≤0.01%

酶学性质

来源：微生物；分类：EC 3.5.3.3；分子量：48 kDa (SDS-PAGE)；等电点：4.6；Km值：1.7×10-2 M(Creatine)；抑制剂：Ag+，Cu2+，Hg2+；最适：pH 7.5；最适温度：45-50℃；pH稳定性4.5-10.0(25℃,16 h)；热稳定性 50℃ 以下稳定(pH 7.5,30 min)；稳定性：-25～-15℃静置保存12个月保持90%以上活性；保护剂：EDTA及糖类物质

用途

水解肌酸，用于酶法肌酐试剂的研发和大量配制。

尿素（Urea）和 DAB（ρ-dimethylaminobenzaldenhyde）反应形成的黄色染料的量可通过分光光度计在 435 nm 检测。

酶活定义

单位酶活定义为在下述条件下，每分钟催化反应生成 1μmol 肌酸完全转化为肌氨酸所需的酶量。

试剂准备

试剂I：0.1 M 肌酸溶液。

试剂II：将 2.0 g DAB 溶解在 100 mL 二甲亚砜中，并加入 15 mL 浓盐酸。

酶稀释液：50 mM PBS，pH 7.5, 样品用酶稀释液将酶稀释至 2.0-3.0 U/mL。

操作步骤

1. 取 1 mL 试剂I于 5 mL EP 管中，37℃ 预热 5 min。

2. 加入0.1 mL 酶液，混匀。

3. 37℃ 水浴反应 10 min 后，加入 2.0 mL 试剂II终止反应，并在 25℃ 放置 20 min。

4. 使用紫外分光光度计，测定反应液在435nm处吸光度值。

5. 酶稀释液代替酶液作为空白对照。

活力计算

3.1：反应液总体积（mL）；

0.1：酶液体积（mL）；

10：反应时间（min）；

1.0：光路长度(cm)；

df：稀释倍数；

C：酶浓度 (mg/mL)；

0.321：黄色染料在 435 nm 处毫摩尔吸光系数 (cm2/μmol)。

Q:一步法RT-PCR试剂盒RT-qPCR逆转录过程

在设计RT-qPCR实验过程中，决定是否要使用总RNA或纯化的mRNA作为模板进行逆转录十分重要。尽管mRNA可能能够提供略高的灵敏度，但总RNA仍经常使用。其原因是总RNA作为起始材料具有较mRNA更重要的优势。首先，其过程需要较少的纯化步骤，这确保了更好的定量回收模板和更好的把结果标准化为起始的细胞数。其次，其避免了mRNA富集步骤，这能够避免由于不同mRNA的回收率不同而带来的结果偏移的可能性。总的来说，由于在大多数的应用中，目标基因的相对定量比检测的绝对灵敏度更为重要，因此在大多数情况下，总RNA更适用 1 。

在两步法中，有三种不同的方法可用于引发cDNA反应：oligo(dT) 引物、随机引物、或序列特异性引物。通常情况下，是将 oligo(dT) 引物和随机引物进行混合使用。这些引物退火至模板 mRNA 链，并提供给逆转录酶一个用于合成的起点位置。

逆转录酶是利用 RNA 合成 DNA 的一种酶。一部分逆转录酶具有 RNA 酶活性，能够在转录后降解 RNA-DNA 杂交链中的 RNA 链。如果其不具有 Rnase 酶活性，可加入 RNaseH 以获得更高的 qPCR 效率。常用的酶包括莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶和禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶。对于 RT-qPCR 来说，理想的情况下是选择具有较高热稳定性的逆转录酶，这样 cDNA 的合成能够在较高的温度下进行，确保成功转录具有较高二级结构的 RNA，同时保持其在整个反应过程中的全部活性，从而得到更高的 cDNA 产量。

RNase H 能够从 RNA-DNA 双链中降解 RNA 链，从而允许双链 DNA 的有效合成。然而，当使用长 mRNA 作为模板，RNA 可能被过早的降解，从而导致截短的 cDNA。因此，在 cDNA 克隆过程中，如果需要合成长的转录物时，尽量减小 RNase H 的活性通常是有益的。与此相反，拥有 RNase H 活性的逆转录酶通常有利于 qPCR 的应用，因为它们能够在 PCR 的第一个循环中提高 RNA-DNA 双链的熔解。

Q:一步法RT-PCR试剂盒RT-qPCR简介

定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法。在该方法中，总RNA或信使RNA（mRNA）首先通过逆转录酶转录成互补DNA（cDNA）。随后，以cDNA为模板进行qPCR反应。RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中，其中包括基因表达分析、RNA干扰验证、微阵列验证、病原体检测、基因测试和疾病研究。

RT-qPCR可通过一步法或两步法来完成，一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起，使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法RT-qPCR只需要利用序列特异性引物。在两步法RT-qPCR中，逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成，使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。

Q:PCR的分类？

PCR有很多种，核心就是用引物扩增特定的DNA，以指数方式倍增的DNA达到可以观察到的量后，通过不同的观察方法比较DNA相对表达的高低。根据检测方式的不同，分为终点 PCR（也即常规PCR）和实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）,根据样本类型的不同，还包括以RNA为模板的反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）。

Q:PCR的概念？

PCR，即聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即模板DNA先经高温变性为单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条引物分别与两条模板DNA链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）为底物，使退火引物得以延伸，如此反复，使位于两段已知序列之间的DNA丨片段呈几何倍数扩增。

Q:RT-pcr试剂盒,RT是什么意思？

Real-time ，是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。此过程中，核酸合成与转录（DNA到RNA）过程与遗传信息的流动方向（RNA到DNA）相反，故称为逆转录。逆转录过程是RNA病毒的复制形式之一，需BIOG逆转录酶的催化。

Q:DNA和RNA提取原理是什么？还有相关试剂盒的原理，各步的作用~~

TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚／SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质．TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。
TRIzol试剂可用于小量样品（50-100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于Western Blotting。

Q:RNA转录为cDNA的试剂盒有哪几种，优缺点各是什么？

MoloneyMurineLeukemiaVirusReverseTranscriptase(M-MLVRT)是一种RNA依赖的DNA聚合酶。它可以以RNA为模板，在适当的引物引导下，通过碱基互补配对的原则，持续渗入dNTPs、形成磷酸二酯键，并最终合成出cDNA。合成出来的cDNA长度可大于5kb。M-MLV酶的RNaseH活性比另外一种常用的逆转录酶AvianMyeloblastosisVirus(AMV)弱，因此更适合于反转录长链RNA。M-MLV逆转录酶的反应活性小于AMV逆转录酶，因此产生相同量的cDNA需要更多分子的M-MLV逆转录酶。

M-MLVReverseTranscriptase的酶活性定义为在37℃将1nmoldNTPs渗入酸可沉淀的物质所需要的酶量。反应的具体条件为50mMTris-HCl(pH=8.3)、7mMMgCl2、40mMKCl、10mMDTT、0.1mg/mlBSA、0.5mM[3H]dTTP、0.025mMoligo(dT)、0.25mMpoly(A)、0.01%NP-40。经检测，OneShineM-MLV酶活性为200U/ul。

Q:碱性磷酸酶酶质量控制？

核酸外切酶活性：5U的本品和1μgλ-HindIIIdigestDNA在37℃下反应16小时，DNA的电泳谱带不发生变化；

核酸内切酶活性：5U的本品和1μgλDNA,在37℃下反应16小时，DNA的电泳谱带不发生变化；

碱性磷酸酶切口酶活性：5U的本品和1μgpBR322在37℃下反应16小时，DNA的电泳谱带不发生变化；RNase活性：5U的本品和1.6μgMS2RNA

在37℃下反应16小时，RNA的电泳谱带不发生变化；

大肠杆菌DNA残留检测：5U本品中残留的核酸经E.coli16srDNA特异性的TaqMan qPCR检测，E.coli基因组残留≤0.1pg/5U。

细菌内毒素（Endotoxin）：LAL-Test，中国药典2020版第四部凝胶限度试验法通则（1143），细菌内毒素含量≤10EU/mg。