上海交大杨广宇、华东师大李大力研究员超迷你CRISPR新进展：422 aa Cas12f1实现PAM扩展与体内高效编辑

导语

CRISPR-Cas 基因编辑已成为生命科学与生物医药的核心工具。但常规的 Cas9/Cas12a由于编码基因太长，难以被AAV载体高效包装递送，长期以来制约体内基因治疗的临床转化。源自Acidibacillus sulfuroxidans的 AsCas12f1 仅有422个氨基酸，是目前已知分子量最小的dsDNA 靶向 CRISPR 核酸酶，具备天然 AAV 递送优势。但野生型 AsCas12f1由于PAM（Protospacer Adjacent Motif）识别非常严格，而且在哺乳动物细胞编辑效率极低，严重限制了其在疾病相关位点的靶向覆盖与治疗应用。

近日，上海交通大学生命科学技术学院杨广宇研究员团队联合华东师范大学生命科学学院李大力研究员团队在《Chemical Engineering Journal》发表重要成果“Directed evolution of a miniature Cas12f1 nuclease from Acidibacillus sulfuroxidans for expanded PAM recognition and enhanced nuclease activity”，通过多轮迭代定向进化改造，获得优势突变体AsCas12f1‑M5（G57R/M114Y/M157V/S188R/D311K），该变体实现PAM识别范围从 5′‑TTR 扩展至 5′‑TYN，可编辑基因组位点覆盖率由～4% 提升至～15%；在哺乳动物细胞内核酸酶活性最高提升11.6倍；并在小鼠肝脏内实现AAV介导的安全高效的基因编辑，为紧凑型CRISPR工具的临床治疗化提供关键突破。

01、改造策略：

结构导向半理性设计 + 迭代定向进化

研究团队基于AsCas12f1‑sgRNA‑dsDNA冷冻电镜结构，分析PAM近端残基对序列特异性的调控作用，以及WED–RuvC二聚界面正电中心沟残基对DNA骨架的稳定作用，共锁定18个PAM互作残基与23个DNA结合残基，旨在弱化碱基特异性氢键与范德华力，放松PAM序列约束，同时增强非特异性DNA骨架静电结合，提升DNA结合与切割效率。

基于大肠杆菌生长偶联高通量筛选平台，添加阿拉伯糖诱导ccdB基因表达，让无法切割靶序列的细菌死亡；只有高效识别并切割含目标PAM的靶序列的突变体，才能让细菌存活。经过五轮迭代组合突变，不断累积优势突变，最终得到性能最优的M5变体。

02、AsCas12f1‑M5

体内外性能评估与功能解析

01、PAM 识别范围显著扩大

野生型：仅识别5′‑TTR（TTA、TTG）

M5：稳定识别8 种 5′‑TYN（TTA、TTG、TTC、TTT、TCA、TCC、TCG、TCT）

理论可靶向基因组位点由~4% 提升至～15%，覆盖范围扩大3–4 倍。

02、体外酶切动力学评估

对经典PAM（TTA/TTG）：15–30 min 几乎完全切割

对非经典PAM（TTC/TTT/TCN）：野生型几乎无活性，M5 保持高效酶切

动力学参数证实：催化速率与底物结合能力同步提升

03、HEK293T细胞内编辑效率评估

研究团队利用eGFxxP报告系统在HEK293T细胞中系统评估了M5的PAM识别与编辑活性：

野生型AsCas12f1仅在5′-TTR位点有效激活eGFP，在非经典PAM位点活性低于10%。

M5在经典PAM位点，eGFP荧光激活提升至62%–67%；在非经典PAM位点活性普遍超20%，一些靶点位点更是突破50%。

在TP53、PDCD1、VEGFA、APOB、PRNP、TTR等多个基因位点中，M5均表现出广谱、高效的编辑能力，显著优于v5.1、enAsCas12f1、YHAM 等现有变体，证明其PAM扩展效果稳定、普适性强。

03、体内验证：

内源基因组编辑与AAV递送体内编辑

研究团队首先在HEK293T细胞中，对覆盖全部8种5′‑TYN PAM的60个内源基因组位点进行编辑效率检测，测定M5在全部5′‑TYN类型PAM均实现高效编辑，证实M5的PAM扩展能力可稳定作用于真实染色质环境。

另外，在小鼠模型中，研究团队通过AAV递送系统，将M5成功应用于肝脏基因编辑，血清中目标蛋白水平下降30%，肝脏组织编辑效率高，低剂量即可起效。同时，肝功能、炎症因子均无异常升高，无明显肝损伤和免疫反应。这些结果表明，该系统在体内应用场景中具有良好的稳定性与安全性。

04、科学意义与价值

突破AAV递送瓶颈：422 aa超小尺寸，单AAV即可装载M5+sgRNA，无需双载体拆分。

拓宽靶向空间：覆盖更多致病突变，适配碱基编辑、先导编辑、多重编辑。

通用工程化范式：为其他Cas12f微型核酸酶改造提供结构指导和筛选流程。

临床价值明确：为肝脏遗传病、代谢疾病等提供新一代紧凑型编辑工具。

05、未来研究展望

1. gRNA 结构与化学修饰：进一步提升稳定性与编辑效率

AsCas12f1‑M5的编辑性能仍可通过gRNA工程化设计实现再度升级。现有研究已证实，对gRNA进行2′‑O‑甲基化、硫代磷酸骨架修饰、末端稳定化改造等化学修饰，可显著增强RNA稳定性、抵抗胞内核酸酶降解等，进而提升编辑效率与特异性。研究团队正在进一步设计开发高稳定性、高靶向效率、低脱靶风险的gRNA，结合优势突变体AsCas12f1‑M5，实现核酸酶与gRNA的高效协同与精准适配。

2. 临床应用前景：面向体内基因治疗的下一代紧凑型工具

AsCas12f1‑M5凭借超小尺寸、广谱PAM、高活性、高安全性四大优势，在临床基因治疗中具备明确转化价值，可覆盖更多遗传病致病位点，尤其适用于肝脏代谢疾病、神经肌肉疾病、眼科遗传病等，后续研究团队将进一步推动M5向更精准、更安全的临床级工具迈进。

内容丨医药酶工程

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