背 景

α-O-寡糖苷类化合物在医药、诊断和食品等领域具有重要应用价值。在急性胰腺炎的临床诊断中，血液淀粉酶活性检测依赖于一种结构精确的寡糖底物EPS-G7，从而实现淀粉酶的特异性、稳定性和高灵敏度检测。

然而，传统化学合成EPS-G7的路线步骤繁琐，需多次保护与去保护，总产率仅约5%，且伴有金属催化剂污染和α/β异构体混杂问题，纯化困难。酶法合成虽条件温和、步骤简便，但天然糖基转移酶（如CGTase）通常伴随复杂副反应，难以控制糖链长度和连接特异性，导致产物杂异质性高。这些困难致使EPS-G7长期以来被国际巨头垄断，国内完全依赖进口，价格高昂、供应链脆弱。

近日，我公司创始人/CTO、上海交通大学生命学院/微生物代谢国家重点实验室——杨广宇博士，作为本篇论文通讯作者，联合论文共同第一作者：上海交通大学生命学院聂挺博士、武汉瀚海新酶生物科技有限公司阎振鑫博士，上海交通大学自然科学研究院洪亮教授、上海天鹜科技有限公司刘灏博士参与本项研究，在《Bioresource Technology》杂志发表了题为“Protein language model-assisted directed evolution of cyclodextrinase enables precision α-O-oligosaccharide synthesis”的研究论文，提出了一种基于蛋白质语言模型的多目标优化策略，成功实现了环糊精水解酶（CDase）的高效定向进化，以环糊精为供体，一步酶催高效合成EPS-G7前体—pNP-G7，产量提升至161 g/L，质量收率107.3%，远超传统化学合成，为α-O-寡糖的精准合成提供了全新解决方案。

主要研究内容

相比传统化学合成路线的局限性，酶促转糖基化法因其简单、特异性、低成本和温和条件而受到青睐。环糊精糖转移酶（CGTase，EC 2.4.1.19）常用于低聚糖转糖基化，通过三元复合物机制将环寡糖（环糊精）转移到受体。然而，CGTase 也会催化环化、歧化和水解，导致大量副产物并限制具有特定聚合度的特定低聚糖的合成。相比之下，来自GH13家族的环糊精酶（CDase，EC 3.2.1.54）具有水解而不是环化的天然偏好，同时保留一定程度的转糖苷活性，这可能为转糖基化提供潜在的新平台。

面对天然CDase通常水解活性远高于转糖苷活性，很难精准控制糖链长度和连接方式，难以满足高纯度EPS-G7的合成要求。研究团队首先建立了一种基于ESBS（额外糖结合空间）motif探针的生物信息学挖掘策略。他们发现，CDase催化口袋中有一处关键区域ESBS，其疏水性强弱可影响酶是倾向于水解脱糖还是转移糖链的关键。通过分析该区域的氨基酸组成与保守性，他们从数万条序列中筛选出104个潜在低水解活性CDase。经过实验验证，最终来自Paenibacillus sp. MY03菌株的CDase脱颖而出。该酶天然具备较高的转糖苷/水解活性比，副产物少，且主要生成目标产物pNP-G7，得率达到63%。

图1a,b

尽管天然MY03 CDase已表现出潜力，但要真正达到工业生产要求，仍需同时实现三个目标的提升：提高转糖苷活性、降低水解活性和增强区域选择性（减少pNP-G7异构体）。然而传统定向进化方法耗时耗力，且难以兼顾多个指标。为进一步优化该酶，研究团队引入了蛋白质语言模型 Pro-PRIME，仅用68个有益单点突变体的实验数据对模型进行微调训练，对转糖苷活性、水解活性和区域选择性三个目标进行联合预测与优化。仅通过Pro-PRIME一轮训练预测，即获得最优三点组合突变体S48W/M358F/D467E（M25），其催化合成pNP-G7产物比例从63%提升至98%，转糖基化/水解比率提高了12倍。

图1c-e

图1（a-e）

基于Pro-PRIME语言模型的多目标优化策略。包括ESBS引导的酶挖掘、单点突变体功能表征、语言模型微调与组合突变体预测，以及高性能突变体的实验验证。

通过分子动力学模拟和结构分析，研究团队揭示了M25（S48W/M358F/D467E）三点突变发挥协同作用抑制水解并促进转糖基化机制，其中S48W突变通过缩小底物通道口径限制水分子进入，抑制水解；而M358F通过增强ESBS区域疏水性促进底物结合，增强与底物芳香环π-π堆叠，提升亲和力；D467E则通过增强极性相互作用稳定糖苷配体，提高转糖基效率；三点突变共同作用，实现了催化性能的全面提升。

图2. M25突变体的机制解析。

（A）通道结构变化；（B）疏水环境增强；（C）动态柔性变化；（D-F）突变位点局部结构对比。

在酶改造成功的基础上，团队进一步优化反应条件，包括pH、缓冲体系、底物浓度与酶用量等，在100 L中试规模体系中，400 g/Lα-环糊精和150 g/L pNP-G的底物条件下，pNP-G7产量达到161 g/L，质量收率达107.3%，纯度高达99%以上，时空产率64.38 g/L·h显著优于传统化学合成法。后续通过一步化学修饰闭环，即可高效获得EPS-G7，总收率超91%，远超化学合成法，且避免了金属污染和异构体难题。

新型 M25 CDase具备广泛的底物适应性，研究团队还尝试了熊果苷、红景天苷、虎杖苷等多种天然产物的寡糖修饰，均取得良好转化效果，这表明它不仅能用于诊断原料生产，更有望成为一款平台型工具酶，用于功能性寡糖苷的绿色生物制造，应用前景广阔。

上海交通大学生命学院/微生物代谢国家重点实验室杨广宇研究员为论文通讯作者。上海交通大学生命学院聂挺博士、武汉瀚海新酶生物科技有限公司阎振鑫博士为论文共同第一作者。上海交通大学自然科学研究院洪亮教授、上海天鹜科技有限公司刘灏博士也参与了本项研究。

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产品信息

内容丨市场部、研发中心

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图片丨来源于瀚海新酶