一周进化5000倍！这套“超突变系统”让蛋白质进化进入快车道

背景

无需复杂设备，无需反复操作，只需一个质粒，就能让目标基因在活细胞内持续超突变，一周内将蛋白质活性提升数千倍！

这听起来像是合成生物学家的梦想，但如今已成为现实。2025年8月7号，美国斯克里普斯研究所Peter Schultz团队在Science上发表了一项重磅研究，开发了一套名为T7-ORACLE的正交复制系统，能够在大肠杆菌中实现持续、高速、靶向的基因超突变，为蛋白质定向进化带来了革命性突破。

传统进化技术的瓶颈

定向进化是优化蛋白质功能的重要策略，但传统方法如易错PCR或DNA shuffling存在明显局限：它们依赖体外的多轮突变-转化-筛选循环，耗时费力，且难以实现深度进化。
虽然近年来出现的体内进化技术（如PACE）提高了效率，但仍存在突变无法精准靶向、可能影响宿主基因组稳定性、或需要特殊设备等问题。

图1 定向进化工作流程示意图

高T7-ORACLE：

一套精准的“基因编辑发动机”

Schultz团队从噬菌体T7中获得灵感，开发了一套完全正交的复制系统。该系统由多个组件构成：T7复制体蛋白：包括RNA聚合酶、DNA聚合酶、解旋酶-引物酶融合蛋白和单链结合蛋白。

系统的具体工作原理：系统通过表达T7 RNA聚合酶、DNA聚合酶、解旋酶-引发酶及单链结合蛋白等关键组分，特异性识别并复制携带T7复制起点的环状目标质粒。其中，为促进复制过程，将水解酶缺陷型T7溶菌酶与T7 RNA聚合酶融合，T7溶菌酶的抑制作用会导致基因循环失败而非完整转录，从而产生短RNA“引物”，供T7 DNA聚合酶在复制起点组装复制体；通过引入工程化的T7 DNA聚合酶（Δ28缺失及N520M、P560V、V443K等关键点突变），显著降低其复制保真度。

图2 T7噬菌体生命周期

I类基因负责编码抗宿主功能基因以及T7 RNA聚合酶；

II类基因负责编码T7复制体；

III类基因负责编码T7封装释放衣壳蛋白等。

图3 系统设计原理示意图

系统包含目标质粒和致突变质粒组，为最大限度增强效果，选用T7复制起点φOR。

最关键的是，该系统只针对质粒上的目标基因进行超突变，完全不干扰宿主基因组，保证了细胞正常生长和高突变率的并行。

如何实现

百万倍突变率提升？

研究团队通过理性设计和定向进化策略，对T7 DNA聚合酶进行了多轮优化：

去除校对功能：使用外切酶缺陷型突变体（Δ28），使突变率提高25倍；

降低碱基选择准确性：引入N520M、P560V和V443K等关键突变，进一步降低复制保真度；

图4 文章所涉及的工程化T7 DNA聚合酶

最终获得的五突变体聚合酶实现了每碱基每代1.7×10⁻⁵的突变率，比宿主基因组突变率高近10万倍，同时保持了极高的转化效率（2.4×10¹⁰ cfu/μg）。

优化后系统的稳定性测试主要包含三部分：

（1）进行波动实验分析，验证系统具有良好的正交性（基因组突变率4.4×10−10 spb）；

（2）测序获得突变谱，验证系统具有突变的无偏性，转换/颠换突变谱均相对均衡；

（3）持续传代，验证质粒的稳定性，代谢无负担，目标质粒大小可达13kb。

图5 优化后系统的稳定性测试内容

应用场景

一周内获得超强 β-内酰胺酶

为了验证系统的实用性，研究人员针对TEM-1 β-内酰胺酶进行了进化实验。仅用不到一周时间，就成功获得了对多种临床重要抗生素（氨曲南、头孢噻肟、头孢他啶和头孢吡肟）抗性提高5000倍的突变体。更重要的是，进化过程中出现的突变（如G238S、R164H、E104K等）与临床耐药菌株中发现的突变高度一致，证明系统能够准确模拟自然进化过程。

图6 β-内酰胺酶的持续进化

突破局部最优

从单一起点到全库进化

T7-ORACLE的最大优势之一是兼容预构建的突变库。研究人员展示了从不同起点进化的效果：从野生型出发，进化路径高度收敛，单向进化事件；从单点饱和突变出发，多个单向进化事件；饱和突变全库出发，多个多向进化事件，有助于寻找全局最优解。

图7 从多起点到全库进化方面探索更广的适应度景观

技术前景与意义

文章工作的突出优势>>

在大肠杆菌系统中生产多肽，依赖于基因重组技术与微生物发酵技术的精密结合，其核心流程包括：

·开发了集合靶向性好、安全性强以及突变距离长等多优势的超进化系统：保持宿主基因组稳定，实现任意长度靶蛋白的进化。

·加速蛋白质功能进化与突破局部最优：整合预多样化突变库，突破单一起点进化的局限，实现从定向进化到全局景观探索的升级。

另外，系统是否能够实现突变在目标基因上的均匀分布和突变偏向启动子近端问题有待研究。

注：

这项研究于2025年8月7日发表在《Science》期刊上，标题为“An orthogonal T7 replisome for continuous hypermutation and accelerated evolution in E. coli”。

原文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/science.adp9583复制链接至浏览器查阅或文末“阅读原文”查看文章内容

作者：钟泽

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图片丨来源于瀚海新酶