前 言
酶，是自然界最神奇的分子机器，从日常生活中的洗衣粉、啤酒酿造，到新能源燃料的开发，酶几乎无处不在，但自然界里的酶往往遇到高温、强酸碱环境就容易失活，想要改造出耐热、耐碱的优质酶变体，关键在于从海量的突变文库中找到极少数的阳性个体。
最近David A. Weitz团队发表于JACS的研究聚焦于酶突变文库筛选新技术，打出“双功能凝胶珠 + 液滴微流控”的组合拳，直接将筛选效率提升至1小时可筛选1000万个变体，单液滴回收率可达80%！今天就和大家一起学习这项 “酶筛选黑科技”。
🔍核心痛点
为什么传统筛选 “又慢又不准”？
01、通量太低工业级酶突变文库常含10⁷-10⁸个变体，传统微孔板一天仅能筛10³个。
02、信号干扰大不同活细胞的生长速率、代谢活性差异会导致酶表达量波动，导致同一个变体在不同细胞里可能给出完全不同的信号。
03、极端条件不兼容活细胞无法满足工业酶在高温、有机溶剂等环境下工作的条件。
这些痛点，让优质酶变体的筛选一直停留在靠运气的阶段，所以亟需一个既快又准、还能去掉细胞干扰的筛选平台。
💡新方法
无细胞+双功能微珠+液滴筛选
这篇研究的核心突破是设计了一种有功能的凝胶珠，直径约45μm的琼脂糖微珠，表面修饰了两种关键工具，这颗微珠就像是一个微型实验室：解决“扩增+表达+检测”全流程，既保证了 “DNA-酶”的精准对应，又杜绝了信号干扰。
PCR引物：能特异性捕获DNA变体，在液滴内完成原位扩增；
SNAP配体：不同活细胞的生长速率、代谢活性差异会导致酶表达量波动，导致同一个变体在不同细胞里可能给出完全不同的信号。
其实在2021年，就有研究提出将无细胞体系包裹在微液滴中实现从DNA扩增到酶活测定的全过程。
但与之相比这个特殊设计的双功能微珠可以克服PCR/滚动循环DNA扩增试剂或蛋白质活性测定所需的试剂与无细胞表达条件不相容的限制，这些微珠可以结合在每一步生成的产物并进行清洗，并使得液滴合并进行试剂交换。
🧩制备和验证双功能琼脂糖微珠
研究首先根据上述流程制备了双功能琼脂糖珠，实现DNA 扩增和蛋白质标记，如图e所示用Qubit单链DNA特异性染料染色和图f用GFP-SNAP标记的双功能琼脂糖珠的荧光显微镜图，并且结合到琼脂糖珠上的GFP浓度与 SNAP 底物BG输入浓度呈依赖关系。
为了验证“单DNA模板→特异性扩增→蛋白表达”的精准关联，DNA 扩增的 “单模板灵敏度” 和 “无假阳性” 是关键前提。研究将PCR 试剂/无细胞表达试剂注入微球中，并以每1分子/10个微球的浓度加入编码GFP-SNAP 的DNA 模板，使用颗粒模板乳液(PTE)乳化珠子，确保每滴只有一个微球，进行PCR/cell-free 表达后破乳清洗珠子去除试剂。凝胶珠可以区分 0 个、1 个和多个DNA 模板的输入，可以实现从单个DNA 模板出发，用于无细胞系统合成和捕获蛋白。
有了好用的双功能凝胶珠，
怎么将其用于突变体文库筛选？
以脂肪酶BsLipA为例，
实现先 “富集”， 再 “精准分离”的多路筛选！
为展示双功能微珠在筛选耐热变体中的效果，研究首先构建了一个含99% 野生型DNA和1%高耐热突变体DNA的脂肪酶BsLipA文库，相比于野生型，该突变体在60°C孵育20分钟后仍保持近乎 100% 活性（图a）。
在筛选中，以1个DNA分子/10个微珠比例装载，完成扩增与蛋白表达后，微珠70℃热处理1h后再与底物反应。结果显示液滴荧光强度分布绝大多数为低荧光，少部分为高荧光，与突变体比例完全一致（图4b）。将回收恢复DNA测序发现回收率可达80%，表明此筛选系统能在阳性变体频率极低（如仅 0.1%）的真实文库筛选场景中，能够实现精准分选，高效回收，无假阳性。
千万级组合突变文库!!
在前期研究的基础上选择了对BsLipA耐热性正向影响最大的15个残基，构建了一个包含千万个不同突变体的组合突变文库，文章提出了一种“多路筛选（初筛）+解复用筛选（复筛）”的两轮筛选策略，实现了通量和精准的平衡。
研究认为初筛的目标不是精准找单个变体，而是快速把阳性群体找到。
高密度加载：研究一步步把DNA加载密度从0.3个提高到20个/微珠，在初筛中允许单个液滴里装20个变体；
信号叠加效应：耐热变体的酶活性是野生型的5-10 倍，所以即使1 个阳性变体和 19 个野生型混在一个液滴里，叠加的荧光信号也会远超纯野生型液滴，可以轻松被分选器识别。
解复用筛选——单变体精准分离，零假阳性
初筛富集后的文库，再用 “低密度加载”（0.1个/液滴）进行复筛，排除共封装干扰。根据泊松分布，0.1个/液滴的密度下，单个液滴含≥2 个 DNA 的概率仅 0.47%，几乎不会出现多个变体共封装的情况。在装载20个DNA/微珠时经两轮分选获得 9 个不同耐热序列，相比于装载0.3/5个DNA，筛选的耐热性提升最大，并且通量从 15 万提升至 1000 万变体，总分选时间仍不足1小时，远远优于传统单变体的筛选模式。
突出优势>>
这篇研究在方法构建中反复验证，整体思路严谨，其创新点在于：
· 巧妙构建了这种双功能琼脂糖微珠，实现 DNA 与蛋白共固定，同时可洗涤多步反应；
· 多重筛选策略，突破液滴筛选通量极限。
总的来说，这篇研究开发了一种基于液滴微流控的超高通量蛋白筛选平台，为突破传统筛选通量低、生物噪音高、反应条件不兼容的瓶颈，研究设计的双功能琼脂糖凝胶珠实现了反应步骤间的完全试剂交换，适配多步不相容反应；同时创新性地引入了多重筛选策略，达到1小时内可筛选 1000 万个变体的高效筛选。
该平台为蛋白质工程提供了高效、稳健的解决方案，在工业酶改造、药物研发等领域具有重要应用价值，也为未来“AI辅助设计+超高通量筛选”的智能化实验模式打下了基础。
原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c04962
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瀚海新酶 Hevo AI+平台
瀚海新酶 Hevo AI+平台，集成“设计—构建—测试—学习”全流程的蛋白优化系统，通过定向进化+AI辅助设计突变文库，结合微流控与无细胞高通量筛选技术，助力实现快速、精准、低成本的蛋白改造，并通过功能验证迭代优化，有效应对上位效应，提升改造成功率，显著缩短研发周期，适用于多种蛋白的功能优化与设计。
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作者：徐泽琦
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图片丨来源于瀚海新酶、网络（侵删）
