概 述

糖基化作为真核蛋白的核心修饰，其结构与含量不仅决定了功能特性，对抗体的稳定性、清除率、免疫原性、抗体依赖细胞毒性(ADCC)及补体依赖细胞毒性(CDC)等有重要性影响。

N-糖基化分析作为抗体药物的关键质量属性，对N-糖基化修饰进行准确鉴定和分析，是确保药物质量与临床效力不可或缺的一环。

传统N-糖分析的局限性

N-糖基化修饰(N-glycans)指糖链通过氮原子与蛋白质上天冬酰胺(Asn)残基的侧链氨基连接，只特异性出现在Asn-X-Ser/Thr(X≠Pro)序列中，核心序列为Manα1-3[Manα1-6]Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-N-Asn-X-Ser/Thr，根据修饰的不同，可分为高甘露糖型、复杂型和杂合型三大类。

传统N-糖分析检测流程为：糖苷内切酶(PNGase F)将糖链酶切释放；衍生标记对游离糖链还原端进行标记；纯化去除未标记糖链和残余试剂；使用UPLC或LC-MS进行分离与鉴定；结果与标准品或糖数据库比对计算各糖型的含量。

传统N-糖分析存在实验周期长、通量低且重复性差的局限性：糖链需要数小时甚至过夜酶切、2-AB标记效率低且信号响应弱、酶切及标记后的样品因浓度低须进行浓缩处理，复杂的纯化步骤导致糖链回收率低和重复性差。

不同衍生标记方法原理

瀚海新酶作为生物制药领域提供核心原料的高科技技术企业，本次受邀亮相展会！

RFMS是一种NHS-氨基甲酸酯，通过NHS-氨基甲酸酯基团与N-糖的伯胺基发生快速反应，形成稳定的脲键(NH–CO–NH)，同时包含一个喹啉荧光基团用于高灵敏度荧光检测，及一个强碱性叔胺基团用于增强质谱电离效率(ESI+)。

· 肼基基团：与糖链还原端经PNGase F酶切后形成的醛基通过肼化学进行快速高效偶联。

· 喹啉荧光基团：提供强荧光信号，便于超高效液相色谱进行荧光检测，实现高灵敏定量。

· 叔胺基团：增强糖链在电喷雾电离正离子模式下的质子化能力，提高质谱检测灵敏度。

2-氨基苯甲酰胺(2-Aminobenzamide)带有芳香胺(-NH₂)基团，与糖链还原末端的醛基缩合形成一个不稳定的中间体席夫碱(C=N)，在还原剂的作用下，不稳定的席夫碱被还原成稳定的仲胺连接(C-N)。

· 糖链还原端醛基与2-AB的氨基形成席不稳定的席夫碱(C=N)。

· 在还原剂(如氰基硼氢化钠或2-甲基吡啶硼烷)作用下，不稳定的席夫碱被还原为稳定的仲胺。

· 由于2-AB不带有荧光增强基团，质谱检测响应信号低。

普鲁卡因胺(Procainamide)在2-AB的结构上增加了叔胺基团，利用ProA分子上的伯胺基团与糖链还原末端的醛基发生还原胺化反应，带有一个叔胺荧光基团，在质谱检测时具有更高的荧光灵敏度。

· ProA与糖链还原端醛基通过还原胺化反应与伯胺基团连接。

· 叔胺基团在质谱中携带质子，其低分子量使衍生化后糖链在反相色谱上的保留时间变化较小。

InstantPC作为普鲁卡因的活性形式，与N-糖的伯胺发生快速反应，形成稳定的脲键(NH–CO–NH)，且结构中含有叔胺，可在正离子模式下产生高质谱信号及易电离的叔胺基团，用于增强质谱电离效率。

· 该衍生物在电喷雾电离条件下会瞬时形成一个永久带正电的基团阳离子。

四种衍生标记总结

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针对传统N-糖检测的局限性，瀚海新酶推出全系列N糖分析方案：

涵盖四种衍生标记方法的快速检测试剂盒。

5min完成酶切，5min完成标记，样本前处理时间仅30min。

酶切效率高，单抗、双抗、ADC、融合蛋白均能完全酶切。

针对2-AB标记和ProA标记，试剂盒不含毒性氰基硼氢化钠，保证操作安全。

试剂盒适配自动化装置，满足高通量样本检测。

试剂盒经过药典级全面的方法学验证研究，包括酶切效率、专属性、重复性、中间精密度、线性、耐用性、检测限、批间差、稳定性、实际样本检测。

检测IgG1/IgG4/融合蛋白，经PNGase F酶切后CE-SDS分析，显示酶切完全。

相同样本，2名人员，平行6份按照试剂盒操作进行前处理，显示G0F的重复性及中间精密度CV值均<10%。、

、

相同样本，相对浓度20%、40%、100%、200%、400%，按照试剂盒操作进行前处理，线性拟合，显示R2>0.99。

相同样本，三批试剂盒，每批次3个重复，按照试剂盒操作进行前处理，显示检测结果一致性高。

05、实际样本测值一致

检测维迪西妥 (HER2-ADC)、曲妥珠 (HER2)、卡度尼利 (PD-1/CTLA-4)、双抗(EGFR×HER3)，峰形图及峰面积与进口品牌一致。

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内容丨市场部-生物药

编辑排版丨品牌

审核丨研发中心、市场部

图片丨来源于瀚海新酶、网络（侵删）