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喜报!瀚海新酶开发出高通量、实时快速体外转录体系筛选系统

来源:瀚海生物市场中心 时间:2022-11-30 作者:瀚海新酶 浏览量:1052

信息速递:体外转录(invitrotranscription,IVT)是指以线性DNA为模板,利用RNA聚合酶、NTP、缓冲体系为原料,酶促合成RNA的技术,是mRNA药物核心组分mRNA分子合成的关键步骤。目前阶段,mRNA药物相关工艺成熟度仍然较低,CMC仍然存在较大挑战。IVT体系优化是CMC过程中的关键环节之一,现有的基于IVT终产物的分析主要依赖于凝胶电泳、毛细管电泳或HPLC,方法耗时、耗力,且无法实时分析体外转录体系,大大限制了体外转录工艺优化效率。因此建立一种精准快速的IVT体系筛选方法将有助于促进mRNA药物相关技术的进步。

2022年11月14日,生物医药和体外诊断核心原料供应商瀚海新酶生物科技有限公司(以下简称“瀚海新酶”)宣布,与上海交通大学杨广宇教授团队合作开发了一套高通量、简单、灵敏的RNA合成监测和定量系统。研究团队通过筛选荧光适配体,建立了基于核酸适配体的IVT体系实时监测系统,可快速进行IVT条件、T7RNA聚合酶活力、启动子、UTR等筛选,为IVT系统化高通量评价与优化提供了更有效的工具。该项研究成果已于2022年10月27日正式在BioresourcesandBioprocessing(以下简称“BIBO”)杂志上发表,被BIBO评为11月推荐文章,该项技术已经申请专利。

喜报!瀚海新酶开发出高通量、实时快速体外转录体系筛选系统插图

瀚海新酶实时快速体外转录体系筛选系统:STAR系统助力mRNA药物研发

新冠病毒COVID-19疫情爆发以来,mRNA疫苗以其在医学领域掀起的巨大变革而荣登2021年《麻省理工科技评论》的“全球十大突破性技术”榜首。由于mRNA药物生产简易、成本低,极大地缩短和降低了新药开发的周期和成本,因此被许多专家认为有可能成为重组蛋白药物、单抗药物之后的生物药第三次浪潮,将对产业和医药领域产生巨大的影响。

体外转录(invitrotranscription,IVT)是mRNA药物合成中的重要技术,对体外转录进行分析对于RNA聚合酶的筛选、启动子的优化、新的抑制转录药物的筛选等方面均具有重要用途。然而,传统的凝胶电泳是实验室分析全长mRNA转录产物的主流方法,只有在IVT完成后才能使用荧光染料或放射性同位素分析RNA的产量和纯度。一些转录副产物,比如流产片段、dsRNA或截短RNA等产物,会导致弥散条带的产生,从而影响结果判定。HPLC和毛细管电泳为RNA分析提供了更准确的定量工具,但是这些方法耗时、耗力,且无法实时分析转录产物的情况。因此建立一种高通量、快速、准确的IVT体系筛选方法,将极大地促进mRNA药物相关技术的进步。

在本研究中,团队开发了一套基于iSpinach适配体的高通量、实时转录活性监测系统,命名为“iSpinachaptamer-basedmonitoringofTranscriptionActivityinReal-time(STAR)”。与基于凝胶电泳的方法相比,二者对体外RNA合成反应的分析结果表现出较高的一致性,但STAR系统的检测速度至少比传统PAGE方法快100倍;STAR系统还可以作为一种快速定量分析T7RNA聚合酶催化活性的方法。

该团队首先设计一段含有荧光适配体编码序列的体外转录DNA模板。在该情况下,只有全长产物并具有正确折叠构象才能与体系中的荧光原结合,产生荧光信号,而转录产物中的流产片段、截短片段等副产物不能产生荧光信号,从而真实的反映该IVT体系中全长产物的生成情况。通过实时检测体系荧光信号强度,获得了一种信噪比更高,更适合于IVT体外转录体系的iSpinach荧光适配体。(图1)

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图1. 体外转录体系荧光适配体筛选

为了进一步验证STAR系统荧光适配体筛选结果,该团队采用传统的变性PAGE法和质谱法,对iSpinach转录产物进行分析。结果显示,除iSpinach目的片段外(72nt),该反应还产生两种3’端延伸度副产物(76nt和85nt),这两种副产物也会产生荧光信号。这一结果符合预期,根据文献报道,T7RNA聚合酶具有较弱的RNA依赖性RNA聚合酶活性;同时根据文献报道,3’端延伸度副产物在RNA总产量中占比不超过10%,因此对STAR系统影响有限。

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图2. iSpinach转录本PAGE和质谱分析结果

随后,作者采用STAR系统,对iSpinach模板的体外转录体系进行优化,具体对NTPs,MgCl2,单价离子,T7RNA聚合酶用量,反应温度,pH几种关键工艺参数分别进行了优化,确定了iSpinachDNA模板的最适反应体系,与聚丙烯酰胺凝胶电泳进行比较,结果均具有较好的一致性。(图3-4)

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图3. 分析NTPs、MgCl2浓度对STAR系统的影响

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图4. 分析温度、pH, 单价离子对STAR系统的影响

根据文献报道,T7RNA聚合酶的催化活性不仅影响体外转录产量,也影响RNA合成速度。传统方法采用同位素标记检测T7RNA聚合酶活性,该方法易产生放射性污染、且成本较高、不适合T7RNA聚合酶活性的高通量筛选。因此建立一种经济有效、无放射性、高通量的T7RNA聚合酶活性检测方法具有重要意义。采用STAR系统即可实时监测不同浓度的T7RNA聚合酶的活性,为酶活的快速表征提供了新方法。(图5)

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图5. SATR系统应用案例:实时监测不同浓度T7 RNA聚合酶活性

转录起始是IVT反应的关键限速步骤,8-10bp的转录起始序列(ITS)对转录起始复合物的稳定性有较大影响,不合适的ITS序列会导致T7RNA聚合酶从DNA模板脱落,产生2-10nt的流产片段,因此对转录产量、完整性具有较大影响。因此对ITS序列的设计对RNA合成具有重要意义。

本研究中,作者采用STAR系统对GFP基因+1至+8位的转录起始序列ITS进行突变。结果发现,转录起始的两个G碱基对T7启动至关重要(图6)。将单点突变显示的能增强T7RNA聚合酶活性的GFP基因ITS位点进行合并突变,并用STAR系统进行分析。最终,3T4T突变体成功使T7RNA聚合酶转录效率提高50%。该案例表明STAR系统是一种可靠的、可以用于快速优化5′-UTR序列的方法。以上结果充分验证了STAR体系的应用潜力。目前该技术已经申请专利。(图6);

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图6. 应用SATR系统监测GFP基因ITS序列突变对体外转录效率的影响

总结:STAR系统可以在5-10分钟内同时分析384个IVT反应可对IVT条件、T7RNA聚合酶活力、启动子序列、UTR序列等维度进行快速筛选优化,为多种指标的优化提供了一个通用的高通量解决方案。下图总结了STAR系统的检测原理(图7);

喜报!瀚海新酶开发出高通量、实时快速体外转录体系筛选系统插图7

图7. 基于iSpinach荧光适配体的转录活性监测系统(STAR)

瀚海新酶全面布局mRNA疫苗原料酶及体外转录服务,赋能新药研发

瀚海新酶可提供体外转录全系列酶原料及试剂、HiSelect高通量体外转录体系筛选服务(基于iSpanich荧光适配体技术),加速IVT体系筛选,迅速的找到最适合自己的那一个best one~~

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图9. 高通量酶促反应条件筛选服务介绍

mRNACRO全流程服务范围:可涵盖序列设计、DNA合成、质粒制备、体外转录工艺优化、mRNA原液制备及检测全流程。更多详细信息,欢迎垂询~

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图10. 瀚海新酶mRNA CRO全流程服务范围

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