新闻中心
NEWS CENTER

国内首款高分辨率,标配四款标准品双链RNA定量检测试剂盒震撼上市

来源:瀚海生物市场中心 时间:2023-01-06 作者:瀚海新酶 浏览量:96

mRNA疫苗是一种利用信使RNA(mRNA)的分子副本来产生免疫反应的疫苗。mRNA疫苗是由脂质纳米颗粒及封装在其中的RNA共同组成,保护RNA链并帮助其吸收进入细胞。因新冠疫情,在疗效、研发速度周期、成本价格、生产的可拓展性和安全性等方面有显著优势的mRNA疫苗技术路线开始备受关注。mRNA原液的制备和转录是疫苗生产的关键步骤,mRNA的质量直接决定了疫苗的临床表现。CDE发布的《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则》和《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则(试行)》均明确指出要控制mRNA相关杂质如5’非帽化RNA、双链RNA(dsRNA)、长链RNA、截短RNA等的含量。

其中,dsRNA的全称是double-stranded RNA,译为双链核糖核酸。在IVT的过程中,T7 RNA聚合酶可能以RNA或DNA(模板链与非模板连)为模板进行转录,形成不同类型的dsRNA副产物:①runoff转录本3’端通过互补序列反向折叠,以同一RNA分子(runoff转录本)为模板进行延伸(顺式)(图1A),或流产转录本与runoff转录本互补配对(反式)(图1B),形成dsRNA。②T7 RNA聚合酶结合在模板dsDNA的5’端和3’端,依赖启动子转录生成正义链run-off转录本,同时可不依赖于启动子转录生成反义链RNA,二者结合形成dsRNA(图1C) [1]瀚海新酶开发出同时兼具检测特异性、灵敏度和普适性的dsRNA ELISA定量检测试剂盒,以满足mRNA领域大规模生产与技术更新迭代的要求。

国内首款高分辨率,标配四款标准品双链RNA定量检测试剂盒震撼上市插图
图1. IVT过程中dsRNA可能的形成机制
包裹mRNA的纳米脂质颗粒(LNP)通过胞吞与内体融合,在内体的酸性环境下,LNP裂解,释放出mRNA,到细胞质中,游离的mRNA遇到核糖体,启动翻译。在内体中,mRNA中的dsRNA杂质被内体膜上的受体蛋白TLR3识别,激活后,TLR3启动信号转导途径,最终导致包括I型干扰素(IFN)在内的促炎性细胞因子分泌(图2)。而进入到细胞质中的dsRNA则主要被RIG-1和MDA5识别(图2),同样地,这两个效应器蛋白被激活后,会上调干扰素的表达[2]。TLR3、RIG-1和MDA5具有不同的RNA识别特异性,RIG-1主要监控dsRNA 5’末端,特别是末端的三磷酸基团(5’PPP),MDA5识别长 dsRNA,依赖的是双链长度(图3) [3],TLR3则可以识别短dsRNA,有研究表明,长度为40-45bp的dsRNA可有效激活TLR3[4]。dsRNA所表现出的免疫原性,一方面会因为自身免疫系统与翻译系统间的反馈调节而降低mRNA的翻译效率[5,6];另一方面,dsRNA使机体形成记忆免疫,当mRNA药物需要重复给药时,会造成药物效力降低[7]。因此,需要在mRNA疫苗药物的生产过程中严格控制dsRNA的含量,这就要求生产厂商能对dsRNA进行精确定量检测。

国内首款高分辨率,标配四款标准品双链RNA定量检测试剂盒震撼上市插图1
图2. 外源RNA激活细胞自身免疫反应的途径

国内首款高分辨率,标配四款标准品双链RNA定量检测试剂盒震撼上市插图2
图3. RIG-1和MDA5识别不同形式dsRNA
dsRNA检测方法包括dot blot(免疫斑点)、ELISA(酶联免疫吸附实验)、HTRF(均相时间分辨荧光)和HPLC。HPLC方法中,dsRNA的峰和主峰有时分不开,分辨率和准确度不够。Dot blot法中,首先将dsRNA标准品和待检mRNA样品滴在尼龙膜上,干燥、封闭后,加入检测抗体J2,孵育1hr后,洗去未结合检抗,再加入酶标二抗,同样孵育1hr后,洗去未结合酶标二抗,加入底物反应显色,通过mRNA样品与dsRNA标准品显色信号的比对来计算mRNA样品中dsRNA的含量[8],该方法操作简便,但是灵敏度不高。目前,开发成商用试剂盒的是ELISA法和HTRF法。HTRF结合了荧光共振能量转移FRET和时间分辨荧光TRF两种技术,该技术以Eu和d2分别标记两种抗体,当两种抗体因为与抗原结合而靠近时,Eu和d2之间发生荧光共振能量转移,产生检测信号。HTRF技术是Cisbio公司的技术专利,其开发的dsRNA检测试剂盒检测范围是1.56-100ng/mL,该试剂盒最大的优势是操作简便,仅需将两只抗体与待测样本混合,于4℃下静置一晚,即可进行检测,因此可将实验操作变异因素降至最低,检测稳定度和再现性高,但需要借助配有时间分辨模块的仪器进行检测。

国内首款高分辨率,标配四款标准品双链RNA定量检测试剂盒震撼上市插图3
图4. Dot blot法操作原理

国内首款高分辨率,标配四款标准品双链RNA定量检测试剂盒震撼上市插图4
图5. Cisbio公司病毒dsRNA检测试剂盒原理(https://www.cisbio.eu/viral-double-stranded-rna-detection-kit-40619)
ELISA是以体外抗原抗体反应为基础,将抗原抗体特异性反应与酶的高效催化作用相结合的一种检测方法,灵敏度可达(pg/mL)水平。它是目前商业应用最为成熟的免疫分析方法之一,在医学实验、临床诊断、生物制药方面的运用也极为广泛。双抗体夹心法,其基本原理是将定量的包被抗体以物理吸附的方法固定于微孔板表面,然后加入待检标本,通过加入检测抗体,酶标记第二抗体后用TMB底物显色,微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈正相关。鉴于酶标二抗的局限性,现在厂家一般引入生物素亲和素系统(biotin avidin system,BAS),这种系统在提高反应灵敏度的同时,应用起来也更加方便。

国内首款高分辨率,标配四款标准品双链RNA定量检测试剂盒震撼上市插图5
图6. 双抗体夹心ELISA法偶联生物素亲和素系统检测原理
表1:目前dsRNA四种检测方法比较
综合目前四种dsRNA检测策略(表1),瀚海新酶开发出同时兼具检测特异性、灵敏度和普适性的dsRNA ELISA定量检测试剂盒,以满足mRNA领域大规模生产与技术更新迭代的要求。试剂盒产品特点包括:
1. 试剂盒搭配四种标准品,且标准品纯度高,定量准确,保证了能对不同修饰类型dsRNA都能精确定量。

国内首款高分辨率,标配四款标准品双链RNA定量检测试剂盒震撼上市插图6

图7. S1核酸酶和RNaseIII酶切验证dsRNA

国内首款高分辨率,标配四款标准品双链RNA定量检测试剂盒震撼上市插图7
图8. 凝胶电泳和CE验证dsRNA纯度

国内首款高分辨率,标配四款标准品双链RNA定量检测试剂盒震撼上市插图8
图9. 抗体对对不同修饰类型dsRNA识别性
2. 测值基本不受dsRNA序列和长度的影响。

国内首款高分辨率,标配四款标准品双链RNA定量检测试剂盒震撼上市插图9

图10. 瀚海剂盒对不同长度、序列dsRNA识别性
3. 试剂盒特异性识别dsRNA,与ssRNA、dsDNA、ssDNA无反应性(图11),性能优良(表2),搭配预包被板,为您提供便捷、准确、稳定的dsRNA定量检测工具。

国内首款高分辨率,标配四款标准品双链RNA定量检测试剂盒震撼上市插图10

图11. 试剂盒特异性识别dsRNA
表2. 瀚海dsRNA定量检测试剂盒(ELISA法)性能总结

国内首款高分辨率,标配四款标准品双链RNA定量检测试剂盒震撼上市插图11
参考文献:[1] Bijoyita Roy, Monica Z. Wu. Understanding and Overcoming the Immune Response from Synthetic mRNAs. Genetic Engineering & Biotechnology News. 2019 Dec 19; 39(12):56-58.[2] Nelson J, Sorensen EW, Mintri S, Rabideau AE, Zheng W, Besin G, Khatwani N, Su SV, Miracco EJ, Issa WJ, Hoge S, Stanton MG, Joyal JL. Impact of mRNA chemistry and manufacturing process on innate immune activation. Sci Adv. 2020 Jun 24;6(26):eaaz6893.[3] Reikine S, Nguyen JB, Modis Y. Pattern Recognition and Signaling Mechanisms of RIG-I and MDA5. Front Immunol. 2014 Jul 23;5:342.[4] Botos I, Liu L, Wang Y, Segal DM, Davies DR. The toll-like receptor 3:dsRNA signaling complex. Biochim Biophys Acta. 2009 Sep-Oct;1789(9-10):667-74.[5] Anderson BR, Muramatsu H, Nallagatla SR, Bevilacqua PC, Sansing LH, Weissman D, Karikó K. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Res. 2010 Sep;38(17):5884-92. [6] Sonenberg N, Hinnebusch AG. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 2009 Feb 20;136(4):731-45. [7] Stanton, M.G., Murphy-Benenato, K.E. Messenger RNA as a Novel Therapeutic Approach. In RNA Therapeutics. Topics in Medicinal Chemistry, : Garner, A. Ed. (Springer International Publishing, 2017), 27:237-253[8] USP. Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality Draft guidelines

创新为要
CREATIVITY
追求卓越
EXCELLENCE
勇于担当
RESPONSIBILITY
合作共赢
COOPERATION
产品对比
产品信息
暂无产品
暂无产品
暂无产品
暂无产品
售价
基本参数
CAS
分子式
纯度
货号
货期
规格

Warning: error_log(/www/wwwroot/www.hzymes.com/wp-content/plugins/spider-analyser/#log/log-2516.txt): failed to open stream: No such file or directory in /www/wwwroot/www.hzymes.com/wp-content/plugins/spider-analyser/spider.class.php on line 3014