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中文：肌酸脒基水解酶CR-T
英文：CR-T
CAS：37340-58-2
分子式：48 kDa(SDS-PAGE)
纯度：≥90%
货期：24h
货号：HH0201-01
规格：5ku
中文同义词：肌酸酶; 肌氨酸酶; 肌酸脱水酶;
英文同义词：EC3.5.3.3; CREATINASE; Creatinase/Aminidase;
技术指标
外观：白色无定型冻干粉末；蛋白纯度：≥90%；比活性：≥6 U/mg 酶粉；过氧化氢酶：≤0.03%；肌酐酶：≤0.01%；肌氨酸氧化酶：≤0.01%；NADH 氧化酶：≤0.01%
酶学性质
来源：微生物；分类：EC 3.5.3.3；分子量：48 kDa(SDS-PAGE)；等电点：4.6；Km值：1.7×10-2 M(Creatine)；抑制剂：Ag+，Cu2+，Hg2+；最适：pH 7.5；最适温度：45-50℃；pH 稳定性4.5-10.0(25℃,16 h)；热稳定性 50℃以下稳定 (pH 7.5,30 min)；稳定性：-25～-15℃ 静置保存 12 个月保持90%以上活性；保护剂：EDTA 及糖类物质
用途：水解肌酸，用于酶法肌酐试剂的研发和大量配制。
尿素（Urea）和 DAB（ρ-dimethylaminobenzaldenhyde）反应形成的黄色染料的量可通过分光光度计在 435 nm 检测。
酶活定义：单位酶活定义为在下述条件下，每分钟催化反应生成 1 μmol 肌酸完全转化为肌氨酸所需的酶量。
试剂准备
试剂I：0.1 M肌酸溶液。
试剂II：将 2.0 g DAB溶解在100 mL 二甲亚砜中，并加入 15 mL 浓盐酸。
酶稀释液：50 mM PBS，pH 7.5, 样品用酶稀释液将酶稀释至 2.0-3.0 U/mL。
操作步骤
1. 取1 mL试剂I于5 mL EP管中，37℃预热5min。
2. 加入0.1 mL酶液，混匀。
3. 37℃ 水浴反应 10 min 后，加入 2.0 mL 试剂II终止反应，并在 25℃ 放置 20 min。
4. 使用紫外分光光度计，测定反应液在435nm处吸光度值。
5. 酶稀释液代替酶液作为空白对照。
活力计算
3.1：反应液总体积（mL）；
0.1：酶液体积（mL）；
10：反应时间（min）；
1.0：光路长度(cm)；
df：稀释倍数；
C：酶浓度(mg/mL)；
0. 321：黄色染料在 435 nm 处毫摩尔吸光系数(cm2/μmol)。
肌酸脒基水解酶用于工业上测定肌酐含量，除此之外，也经常被用于临床分析诊断血清和尿液中肌酐含量和与健康机体中肌酐含量不同的肾脏疾病。肌酐是应用人体磷酸肌酸代谢的最终产物，经肾脏过滤后，再从血液中进入尿液，排出体外。
肌酸脒基水解酶是酶促方法检测肌酐含量的必不可少的酶，它能够将肌酸转化成肌氨酸和尿素，进一步生成能够进行化学检测的过氧化氢。该酶主要来源于微生物，目前已被广泛应用于医疗诊断、有机合成等行业。
肌酸酶与肌氨酸氧化酶混合可用于测定不同pH值、温度、酶比和缓冲液浓度下的肌酸水平。也可以通过使用离心分析仪来测定血浆肌酐水平。
肌酸酶是催化肌酸水解的同型二聚体。它由两个单体亚基和两个定义的结构域（N末端域和C末端域）组成。C末端折叠在两个结构相似的域内具有α螺旋和反平行β片。在这两个结构域之间，有一个巯基充当活性位点，并且活性与金属无关。
肌酐酶法是用肌酐酶催化肌酐后，据其水解物的测定来测定血肌酐值的方法。由于酶是在活细胞内产生的一种蛋白质，在细胞内或分泌到细胞外起同样的催化作用。酶是生物体进行新陈代谢必不可少的物质，虽然酶法成本高，但由于酶相对特异性好，目前多采用酶法测定血肌酐值。由于医院的不同、试剂的不同、测定仪器的不同，故测定血肌酐值参考值范围也不同。因此，检查血肌酐值的正常与否及其前后对照，要在同一个医院进行测定与比较。
肌氨酸氧化酶简称SOX，是肌酐降解代谢途径中的第三个酶，能专一性地催化底物肌氨酸生成甘氨酸。肌氨酸氧化酶在临床诊断中有广泛的应用，通过肌氨酸氧化酶偶联肌酐酶、肌酸酶测定血清中肌酐的含量，是判断肾脏功能的一个重要参考指标，在医药领域具有良好的应用前景。
肌氨酸氧化酶可以氧化肌氨酸成甘氨酸和甲醛。它和肌酐酶和肌酸酶一起用于肌酐酶法检测。本品仅供科研使用。
一种制备肌氨酸氧化酶的方法。这种方法的原理主要在于：将优化后的肌氨酸氧化酶编码基因插入构建好的表达载体，在大肠杆菌中诱导其高效表达，该方法具体为：肌氨酸氧化酶表达载体的构建：通过基因工程手段利用NdeI和XhoI位点将其克隆至PRSFDuet载体内，并转化大肠杆菌TOP10菌株，挑取数个转化克隆提取质粒，通过限制性内切酶酶切鉴定目的基因是否插入载体，选取插入目的基因的质粒进行DNA序列测定，结果表明肌氨酸氧化酶基因成功克隆至pRSFDuet载体内，将其命名为SAOpRSF。
1.肌氨酸氧化酶以BL21(DE3)为宿主菌，将SAOpRSF进行转化，挑取单菌落于3mlLB培养基培养过夜；2.以1∶500比例将菌液转接至400mlLB培养基，恒温在37℃，230rpm培养至OD600＝0.4‑0.6；3.加IPTG诱导，IPTG诱导终浓度为0.5mM，保持25℃条件下表达8小时后收菌。BL21(DE3)菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。普通大肠杆菌没有t7RNA聚合酶，所以不能表达那些载体上的基因。λ噬菌体DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶，该区整合于BL21的染色体上，就叫BL21(DE3)。
1.取400ml培养液3000rpm离心分离10分钟后收集菌体，肌氨酸氧化酶菌体重悬于10ml蛋白提取缓冲液中(50mMNa‑PO4，pH8.0，500mMNaCl，10mMImidazle)，15MPa高压破菌，12,000rpm，4℃离心10min，上清液与Ni‑NTA冰上孵育1小时；2.过Ni‑NTA亲和层析柱，用蛋白提取buffer洗涤，最后用250mMImidazle洗脱，收集洗脱液。3.蛋白洗脱液过G50柱去除Imidazle，这样可以得到95％以上纯度的SAO。4.肌氨酸氧化酶活性测定：制备肌氨酸氧化酶的纯品用奥林巴斯AU5400生化仪测定活性，酶活可达30000U/L，且‑20℃甘油冻存6个月，酶活基本保持不变。
