背 景

11月10日，美国AHA年会，默沙东公布了全球首个口服PCSK9抑制剂(MK-0616-Enlicitide)的临床III期研究结果：Enlicitide decanoate在降脂方面展现出显著疗效且安全性良好。MK-0616前体是默沙东借助Ra Pharma的mRNA展示环肽库筛选出来的先导化合物，MK-0616复杂分子结构的合成通过酶促催化合成和“北片段与南片段”分步合成策略，优化结晶工艺以避免色谱纯化，最终实现百公斤级的大规模合成。

Enlicitide作为小分子大环肽类化合物，通过特异性结合肝脏表达的PCSK9(前蛋白转化酶枯草溶菌素9)蛋白，阻断PCSK9与LDL受体结合从而减少LDL受体的降解，增强肝脏对LDL-C的清除能力，从而显著降低血浆低密度脂蛋白胆固醇水平。

Enlicitide在降脂领域的CORALreef Lipids和CORALreef HeFH两项III期临床研究显示：(1) CORALreef Lipids 是一项评估Enlicitide在有动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)风险或有ASCVD事件史的成年人中降低LDL-C有效性和安全性的Ⅲ期研究，对已接受稳定降脂疗法治疗或对他汀类药物不耐受的有ASCVD事件史或有 ASCVD 风险的成年人，每日一次口服 Enlicitide 后，在第 24 周主要LDL-C降幅为55.8%，67.5%的患者LDL-C较基线降低至少50%且绝对值＜55mg/dL(1.42 mmol/L)，且Enlicitide在第52周保持LDL-C降幅为47.6%。(2) CORALreef HeFH是一项评估Enlicitide在具有杂合子型家族性高胆固醇血症(HeFH)患者中降低LDL-C有效性和安全性的III期研究，对接受稳定降脂治疗的HeFH成年患者使用Enlicitide后，在第24周和第52周实现了LDL-C降幅为59.4%和61.5%。

多肽筛选有DEL文库筛选、噬菌体展示和mRNA展示：DEL文库筛选的库容可达1011 ，容易引入非蛋白源氨基酸序列，可对环肽骨架和侧链进行多样性修饰，同时连接的DNA便于苗头化合物鉴别；噬菌体展示的多样性较低，且在体内噬菌体表面表达存在局限性；mRNA展示技术起始于1997年，序列多样性使得库容可达1012-1014，且在体外进行表达避免了局限性，且可以引入非天然氨基酸。

mRNA展示技术实验流程为：

(1)DNA序列库与体外转录：构建编码mRNA的大容量DNA序列库，在体外使用T7 RNA聚合酶将DNA转录成mRNA。(2)嘌呤霉素(Puromycin)连接：通过短连接子将mRNA文库和嘌呤霉素进行连接。(3)体外翻译：核糖体以mRNA-嘌呤霉素为模板进行体外翻译，到3'端时嘌呤霉素进入核糖体A位点与肽链C端连接形成酰胺键终止翻译，形成mRNA-嘌呤霉素-肽复合物。(4)肽环化：使用DSG/DBX/TCEP/NаBH3CN/CuAAC等方式将多肽间进行连接，从而实现多肽环化。

(5)cDNA逆转录：通过RT-PCR反应进行逆转录，获得与mRNA序列互补的DNA链，即cDNA/mRNA-嘌呤霉素-肽复合物。(6)筛选：将目标靶点固定在磁珠上，经过5~10轮亲和筛选后得到高特异性结合目标靶点的cDNA/mRNA-嘌呤霉素-多肽-蛋白复合物。(7)扩增和富集：通过高温释放蛋白或高pH释放cDNA链，进行PCR扩增后进行测序，确定高特异性结合目标蛋白的多肽结构。

默沙东与 Ra Pharma合作，利用 mRNA展示技术构建含两个反应性巯基的线性肽库，通过1,3-二(溴甲基)苯(DBX)交联环化，筛选获得两个候选肽: 化合物13的LDL受体结合活性134nM，经LDLR-FRET Assay检测有显著的抑制作用；化合物12的LDL受体结合活性956nM较弱一些，独特空间结构便于后续优化。

MK-0616源于mRNA展示技术筛选的大环肽但结构复杂：氨基酸序列(由8个氨基酸组成，6个为非天然氨基酸并通过特定的化学修饰和连接形成线性肽链)、大环结构(包含37元大环，通过三唑、烯键和硫醚连接形成独特的三元环结构，限制分子构象并增强稳定性)、非肽片段(连接在大环结构上，增加分子复杂性和结合特异性)、末端含铵侧链(参与分子与靶蛋白PCSK9的结合并影响分子的电荷分布和水溶性)、癸酸盐作为促渗透剂(提高口服生物利用度)，复杂的分子结构使得MK-0616的固相合成复杂困难。

中间体1-Northern Fragment的新路线合成路线如下：以5-F-色氨酸为起始原料，经过5步合成，单批次制备150kg以上，总收率达50%。

以NMP为溶剂，叔丁醇钠为碱，和烯丙基氯反应，将烯丙基氯的当量增加至1.8，叔丁醇钠的当量控制在2.01~2.05，溶剂NMP的含水量控制在300 ppm以下，可以将副产物14的含量控制在1%以下，后处理时用盐酸将反应液pH调节至1~2，使副产物14水解成原料5，然后使用5%的Na2CO3水溶液中和反应液，产物结晶析出，过滤得到目标化合物6。

HATU当量为1.0，DIPEA当量为1.2，有17.2%的副产物15生成，一方面可能残留的HATU/DIPEA活化了化合物8中的羧基生成中间体8-INT，和化合物6反应生成副产物15，另一方面在DIPEA的作用下，化合物8和中间体7-INT发生酯交换生成8-INT，和化合物6反应生成副产物15。优化后HATU当量1.0，DIPEA当量1.0，并改变投料顺序将HATU/DIPEA活化7生成的中间体7-INT缓慢滴加到6的反应液中，可将副产物15的含量降低至1.2%。

使用纯化后的化合物8进行反应时，需额外添加1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)将异构体含量控制在1.5%以下，由于HOAt浓度升高加速了活性酯的形成，同时通过噁唑酮生成途径减缓了异构化反应，而HOAt在第一步偶联中已生成，无需额外添加HOAt从而进一步降低了成本。在化合物8的反应流直接加入1.15当量化合物9、1.3当量HATU和2.4当量DIPEA，随后采用既定后处理流程以MTBE溶液形式获得目标化合物10，在>200 kg规模下两步反应实现87%收率和90.8%的纯度。该一锅法工艺使化合物10的收率提高10%，时间周期缩短36%。

图. 以Cbz-反式-3-羟基-L-脯氨酸为基础合成化合物9

图. 一锅法合成化合物10

使用质子酸盐酸、硫酸、以及三氟乙酸脱保护基，收率很低且脱保护基不完全。采用TMSI脱保护化合物10在MeCN中进行(MeCN较DCM更具环保优势)，5.0当量TMSI可实现该反应的最佳转化效果。除温和反应条件与高收率外，TMSI介导的脱保护反应可实现化合物11的结晶形态，仅通过一次分离即可从三步反应中获得高纯度产物。反应终止时加入5.0当量水进行淬灭，并通过溶剂置换至2-甲基四氢呋喃实现目标化合物11结晶。该工艺在147千克规模验证分离收率达89%，纯度超过98%。

化合物11中有两个未保护的氨基，存在定向选择性问题，在初始条件下(T3P-6.0 eq、NMI-1.4 eq、DMF-16mL/g、-5°C反应40h)有6~8%的副产物16生成。通过高通量筛选反应条件，以EDCI/HOPO为缩合剂的反应效果较好(EDCI-3.4 eq、HOPO-2.0 eq、MgCl2-3.0 eq、DMAc-10mL/g、-5°C反应25h)可以实现97.4%的纯度和75%的收率。

瀚海新酶基于酶促合成中间体技术平台和蛋白定向进化及Hevo AI+辅助设计平台，开发了酶促合成工艺的MK-0616原料：L-5-氟色氨酸和反式-3-羟基-L-脯氨酸，纯度>99%，单杂<0.5%，满足MK-0616产品的大规模原料需求。

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参考文献

[1] Peacock H, Suga H. Discovery of De Novo macrocyclic peptides by messenger RNA display. Trends in Pharmacological Sciences, 2021, 42(5), 385-397

[2] Kamalinia G, Grindel B J, Takahashi T T, Millward S W. Directing evolution of novel ligands by mRNA display. Chem. Soc. Rev. 50 9055–103

[3] Alleyne C, et al. Series of Novel and Highly Potent Cyclic Peptide PCSK9 Inhibitors Derived from an mRNA Display Screen and Optimized via Structure-Based Design. J. Med. Chem. 2020, 63 (22), 13796–13824

[4] Kai-Jiong Xiao，Yong-gang Chen. Process Development toward a Key Fragment of the PCSK9 Inhibitor Enlicitide Decanoate. Organic Process Research & Development Article ASAP

内容丨研发中心、市场部-生物药

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审核丨研发中心、市场部

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