2×HF 高保真预混液（含染料）是即用型 2×预混合溶液，包含 HF(High-Fidelity)高保真 DNA Polymerase、dNTPs 和精心优化的反应缓冲液，只需加入模板、引物和水即可进行高保真 PCR 反应。HF DNA Polymerase 为定向进化得到的高保真酶，其保真度是普通 Taq 酶的 70 倍，扩增速度是 Pfu 的 5 倍。2×HF 高保真预混液（含染料）中添加了独特的延伸因子和特异性促进因子，使其在长片段扩增能力、扩增特异性以及扩增产量方面得到了大幅度提升。使用 λDNA、质粒等简单模板时，2×HF 高保真预混液（含染料）可以轻松扩增长达 20kb 的片段；而使用基因组 DNA 等复杂模板时，2×HF 高保真预混液（含染料）能有效扩增长达 12kb 的片段。此外，2×HF 高保真预混液（含染料）对 PCR 抑制剂具有良好的耐受能力，对粗提样本也能进行很好的扩增。预混液中包含红色和黄色示踪染料，可将产物直接用于凝胶电泳。预混液中的红色染料与 1500bp 双链 DNA 片段在 1%琼脂糖凝胶中迁移速率接近；黄色染料与 10bp 双链 DNA 片段在 1%琼脂糖凝胶中迁移速率接近。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| 2×HF高保真预混液（含染料） | HSM020351-01 | 1 mL |
| HSM020351-02 | 5×1 mL | |
| HSM020351-03 | 20×1 mL | |
| HSM020351-04 | 0.25 mL |
产品组分
| 组分 | HSM020351-01 | HSM020351-02 |
|---|---|---|
| 2×HF高保真预混液（含染料） | HSM020351A 1mL | HSM020351A 5×1mL |
| PCR Enhancer | HSM020351B 1mL | HSM020351B 1mL |
| 组分 | HSM020351-03 | HSM020351-04 |
|---|---|---|
| 2×HF高保真预混液（含染料） | HSM020351A 20×1mL | HSM020351A 0.25mL |
| PCR Enhancer | HSM020351B 5×1mL | HSM020351B 0.2mL |
适用范围
本产品适用于以基因组 DNA、cDNA、质粒以及粗品为模板的 PCR 反应。
反应体系和条件
反应液按下表配置：
| 组分 | 体积 |
|---|---|
| 2×HF高保真预混液（含染料） | 25 μL |
| PCR Enhancer（可选）* | 10 μL |
| 正向引物（10 μM） | 1 μL |
| 反向引物（10 μM） | 1 μL |
| 模板 DNA | x μL |
| ddH2O | To 50 μL |
注*：当扩增片段 GC 含量>60%且优化条件也无法正常扩增时，推荐使用 PCR Enhancer 来优化 PCR 反应。与无染料的 2×HF 高保真预混液相比，HSM020351 所需的 PCR Enhancer 更少，请避免加入过量 Enhancer 导致扩增失败。程序推荐：降落 PCR 程序。
模板用量推荐
| 模板种类 | 推荐用量 |
|---|---|
| 基因组 DNA | 10~200 ng |
| 质粒或病毒 DNA | 10 pg~50 ng |
| cDNA | 1~5 μL（不超过 PCR 反应总体积的 1/10） |
| 粗品 | 1~5 μL（不超过 PCR 反应总体积的 1/10） |
扩增程序
① 三步法 PCR 反应程序
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环 |
|---|---|---|---|
| 预变性a | 95℃ | 3~5min | 1 |
| 变性 | 95℃ | 10s | 30~35 |
| 退火b | 55~72℃ | 15s | |
| 延伸c | 72℃ | 30s/kb | |
| 终延伸 | 72℃ | 5min | 1 |
a. 对于普通模板，预变性可缩短至 30~60s；对于复杂模板，例如高 GC 序列，推荐延长预变性时间到 3~5min 以充分变性；大肠杆菌菌落 PCR：建议将预变性调整 10min，无需预裂解即可高效扩增；酵母菌菌落 PCR：无需调整预变性时间，但需要对酵母菌进行预裂解。建议向酵母菌中添加终浓度 20mM 的 NaOH 后 95℃预裂解 10min，或将酵母菌使用液氮反复冻融 2~5 次。
b. 根据引物 Tm 值设置退火温度。如引物 Tm 值≥72℃，可删除退火步骤，直接进行后续的延伸步骤（两步法 PCR）。如果需要，可以建立一个温度梯度寻找引物与模板结合的最适温度。此外，退火温度直接决定扩增特异性。如发现扩增特异性差，可适当提高退火温度。
c. 对于大多数模板，30s/kb 即可有效扩增；对于一些复杂模板，可延长延伸时间至 30~60s/kb。
② 两步法 PCR 反应程序d
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环 |
|---|---|---|---|
| 预变性a | 95℃ | 3~5min | 1 |
| 变性 | 95℃ | 10s | 30~35 |
| 退火&延伸 | 65~68℃ | 30s/kb | |
| 终延伸 | 72℃ | 5min | 1 |
d. 通常情况下使用两步法和三步法进行 PCR 扩增，性能无显著差异，可以根据操作习惯自行选择。但对于一些复杂模板（如长片段，Tm 分布不均匀，特殊结构模板），可以尝试两步法或者降落 PCR 法。此外，使用质粒为模板进行点突变时，也建议使用两步法。
③ 降落 PCR 反应程序e
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环 |
|---|---|---|---|
| 预变性 | 95℃ | 3~5min | 1 |
| 变性 | 95℃ | 10s | 30~40 |
| 退火 | 68℃（-0.2℃/cycle） | 15s | |
| 延伸 | 72℃ | 30s/kb | |
| 终延伸 | 72℃ | 5min | 1 |
e. 该程序仅供参考，降落 PCR 有多种程序可灵活调整，请根据实验需求与习惯自行决定是否采用。
注意事项
1. 请不要使用含尿嘧啶的引物和模板。
2. HF 高保真 DNA Polymerase 具有较强的校正活性，产生的扩增产物是平末端，如果用于下一步克隆实验，建议使用平末端克隆。如果扩增产物需要用于 TA 克隆，加 A 之前须先进行 DNA 纯化。
3. 为了提高扩增成功率和产量，请使用高质量的模板。
4. 请设置 PCR 仪程序时选择“Tube”而不是“Block”模式，部分机型两种模式升降温差异较大，“Block”模式可能导致复杂模板扩增失败。
常见问题
| 问题描述 | 可能原因 | 解决办法 |
|---|---|---|
| 无产物或产物量少 | 引物 | 优化引物设计 |
| 退火温度 | 设置退火温度梯度，找到合适的退火温度 | |
| 引物浓度 | 适当提高引物浓度 | |
| 延伸时间 | 适当增加延伸时间至 30~60s/kb | |
| 循环数 | 增加循环数至 36~40 个循环 | |
| 模板纯度 | 使用高纯度模板 | |
| 模板使用量 | 使用量参照反应体系推荐量调整并适当增加 | |
| 有杂带或弥散条带 | 引物 | 优化引物设计 |
| 退火温度 | 尝试提高退火温度并设置退火温度梯度 | |
| 引物浓度 | 适当降低引物浓度 | |
| 循环数 | 减少循环数至 25~30 个循环 | |
| 模板纯度 | 使用高纯度模板 | |
| 模板使用量 | 使用量参照反应体系推荐量调整并适当减少 |
