探针法荧光定量 PCR 预混液（无 ROX）是基于独特的双组份热启动 Taq 聚合酶开发的实时定量 PCR 用 2× 预混液。本产品已包含除引物和样品 DNA 以外的所有荧光定量 PCR 组分，可减少操作步骤，缩短加样时间，降低了污染几率，适用于以 cDNA 或 DNA 为样品的 TaqMan 探针法检测。
由于部分品牌型号荧光定量 PCR 仪的设计原因，这些仪器 PCR 孔之间的荧光信号存在微小差异，因此需要加入参考染料（Reference Dye）加以校正。本系列产品配有不同浓度的 ROX Reference Dye,请根据不同机型针对性选用。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| 探针法荧光定量 PCR预混液（无 ROX） | HSM030061 | 5×1 mL |
使用说明
适配机型
| Rox 含量 | 适用机型 |
| NoneROX | Bio-Rad CFX 全系列； Roche LightCycler™ 系列； Eppendorf Mastercycler® ep realplex 系列； Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 系列； Takara Thermal Cycler Dice； analytikjena qTOWER 系列等。 |
| LowROX | ABI 7500/7500 Fast，ABI ViiA 7™； ABI QuantStudio™ 系列； Stratagene Mx3000P®/3005P™/4000™ |
| HighROX | ABI 7000/7300/7700/7900 HT/7900 HT Fast， StepOne™，StepOne Plus™等 |
2. 使用注意
① 因 Mix 中预混有染料，其保存或反应体系配制过程应避免强光照射；
②使用前上下颠倒轻轻混匀 Mix，请勿涡旋振荡混匀，避免产生过多气泡。
3. 建议的 qPCR 反应体系
| 试剂 | 使用量 | 终浓度 |
| 探针法荧光定量 PCR预混液（无ROX） | 10μL | 1× |
| 正向引物 (10 μM)a | 0.4μL | 0.2 μM |
| 反向引物 (10 μM)a | 0.4μL | 0.2 μM |
| TaqMan 探针 (5 μM)b | 1μL | 0.25 μM |
| DNA 模板c | XμL | 10~200ng/20μL |
| Nuclease-Free Water | To 20μL |
a．通常推荐的引物终浓度为 0.2 μM，反应效果不佳时可在 0.1~1 μM 范围内进行调整；
b．推荐模板加样量为 1~2 μL，如模板类型为未稀释 cDNA 原液，模板添加量不应超过总反应体系的 10%。不同种类 DNA 模板中含有的靶基因拷贝数目不同，必要时可进行梯度稀释，以确定最佳的 DNA 模板添加量。
c. 模板添加量不应超过总反应体系的 10%， 推荐加样量为 1~2 μl。不同种类 DNA 模板中含有的靶基因拷贝数目不同，必要时可进行梯度稀释，以确定最佳的 DNA 模板添加量。
2. qPCR 参数设置（可根据机型适当调整）
两步法
| 步骤 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 95℃ | 5min |
| 变性 | 95℃ | 10s |
| 退火 & 延伸 | 60℃ | 30s |
注意事项
① 使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡， 并经短暂离心后使用。
② 避免反复冻融 Mix，开启后尽量在 3 个月内使用完毕。
常见问题及解决办法
1.扩增曲线混乱或缺失
①仪器设置不正确根据仪器说明书调整设置；
②引物或模板浓度不当调整引物和模板浓度；
③PCR 反应条件不当降低退火温度、延长延伸时间等。对于 GC 含量高的目标片段，可适当延长变性时间；
④引物或模板存在高级结构重新设计引物；
⑤样品纯度不好进一步纯化样品；
2.定量值重复性差
①仪器设置不正确根据仪器说明书调整设置；
②样品纯度不好进一步纯化样品；
③引物浓度不当尝试适当提高引物浓度；
④PCR 反应条件不当尝试降低退火温度、延长延伸时间等；
⑤引物设计不当重新设计引物，减少目标片段的高级结构；
⑥实验操作误差严格按照操作规程，保证反应体系中各组分体积精确
3.空白对照出现信号
①出现污染首先更换空白对照的水，如果还发生同样情况， 继续更换引物、吸头、管或启用新的 MixPCR。
