SYBR qPCR Master Mix（高敏） 是 2× 实时定量 PCR 扩增的预溶液，具有高灵敏度和高特异性的特点。核心组分 Taq DNA 聚合酶采用抗体法热启动，可以有效抑制样品准备过程中引物退火导致的非特异性扩增。同时配方添加了提升 PCR 反应扩增效率因子和均衡不同 GC 含量（30~70%）基因扩增的促进因子，使定量 PCR 可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。
本产品中含有特殊的 ROX Passive ReferenceDye，适用于所有 qPCR 仪器，无需在不同的仪器上调整 ROX 的浓度，只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。 运输与保存冰袋运输，-25~-15℃保存，有效期 18 个月。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| SYBR qPCR Master Mix（高敏） | HSM030021 | 500 T/5×1 mL |
| HSM030021-01 | 100 T/1 mL |
使用方法
反应体系:
| 组分 | 规格 | 规格(μ | 终浓度 |
| SYBRGreenMaster Mix | (μL） 25 | L） 10 | 1× |
| ForwardPrimer(10 μM) | 1 | 0.4 | 0.2 μM |
| ReversePrimer(10 μM) | 1 | 0.4 | 0.2 μM |
| 模板 DNA |
X |
X |
- |
| 无菌超纯水 | to50 | to20 | - |
【注】：使用前务必充分混匀， 避免剧烈震荡产生过多气泡。
a) 引物浓度：通常引物终浓度为 0.2 μM，也可以根据情况在 0.1-1.0 μM 之间进行调整。
b) 模板浓度：如模板为未稀释 cDNA 原液，使用体积不应超过 qPCR 反应总体积的 1/10。
c) 模板稀释：cDNA 原液建议 5-10 倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的 Ct 值在 20-30 个循环为好。
d) 反应体系：推荐使用 20 μL 或 50 μL ，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
e) 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。
标准程序
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 预变性 | 95℃ | 2min | 1 |
| 变性 | 95℃ | 10 sec | |
| 退火/延伸 | 60℃ | 30 sec★ | 40 |
| 熔解曲线阶段 | 仪器默认设置 | 1 | |
快速程序
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 预变性 | 95℃ | 30 sec | 1 |
| 变性 | 95℃ | 3 sec | |
| 退火/延伸 | 60℃ | 20 sec★ | 40 |
| 熔解曲线阶段 | 仪器默认设置 | 1 | |
【注】 快速程序适用于绝大多数基因， 个别复杂二级结构基因可尝试标准程序。
a) 退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。
b) 荧光信号采集(★)： 请勿忘记打开荧光信号采集，按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置。
几种常见仪器的时间设定如下：
20 sec ： Applied Biosystems 7700, 7900HT,7500 Fast
31sec：Applied Biosystems7300
32 sec：Applied Biosystems7500
c) 熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。
结果分析: 定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。
1) 扩增曲线：标准扩增曲线为S 型。
Ct 值落在 20-30 之间时，定量分析最准确；
Ct 值小于 10 ，需要将稀释模板后， 重新进行实验；
Ct 值介于 30-35 之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积， 以提高扩增效率，保证结果分析的准确性； Ct 值大于 35 时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。
2) 熔解曲线：
熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。
熔解曲线出现双峰，需要通过DNA 琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。
如果是引物二聚体，建议降低引物浓度， 或者重新设计扩增效率高的引物。
如果是非特异性扩增，请提高退火温度， 或者重新设计更高特异性的引物。
引物设计指南
1.推荐引物长度 25 bp 左右。扩增产物长度 150 bp 为佳，可以在 100 bp-300 bp 内选择。
2.正向引物和反向引物的 Tm 值相差不宜超过 2℃ 。引物 Tm 值 60℃-65℃为佳。
3.引物碱基分布要均匀，避免出现连续的 4 个相同碱基， GC 含量控制在 50%左右。3’ 端最后一个碱基最好为 G 或 C。
4.引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有 3 个碱基以上的互补序列。
5.引物特异性需要用 NCBI BLAST 程序进行核对。避免引物 3’端有 2 个碱基以上的非特异性互补。
6.设计完成的引物需要进行扩增效率的检测， 只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。
注意事项
1.推荐使用本公司 cDNA 合成试剂盒（货号： HSM030011），以有效去除 RNA 样品中残留的基因组。
2.解冻后 Master Mix 可能出现絮状或白色沉淀，手握缓慢溶解并上下轻柔颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。
3.为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
4.本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
