化学热启动染料法荧光定量PCR预混液（独立ROX）是SYBR® Green I嵌合染料法专用qPCR试剂，为2×预混液，包含除引物和DNA样品以外的所有qPCR组分，可减少操作步骤，缩短加样时间，降低污染几率。其核心组分是经化学法修饰的热启动Taq DNA聚合酶，配合精心优化的Buffer体系，有效抑制非特异性扩增，可对宽广浓度范围的模进确定量，获得稳定可靠的qPCR结果。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 包装规格 |
| 化学热启动染料法荧光定量PCR预混液（独立ROX） | HSM030033 | 5 mL |
产品组分
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| 化学热启动染料法荧光定量PCR预混液（独立ROX） | HSM030033A | 5×1 mL |
| Low ROX Dye (100×) | HSM030033B | 100 μL |
| High ROX Dye (100×) | HSM030033C | 100 μL |
使用说明
1. 适配机型
| ROX含量 | 适用机型 |
| None ROX | Bio-Rad CFX 全系列； Roche LightCycler™ 系列； Eppendorf Mastercycler® ep realplex 系列； Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 系列； Takara Thermal Cycler Dice； analytikjena qTOWER 系列等。 |
| Low ROX | ABI 7500/7500 Fast，ABI ViiA 7™； ABI QuantStudio™ 系列； Stratagene Mx3000P®/3005P™/4000™ |
| High ROX | ABI 7000/7300/7700/7900 HT/7900 HT Fast， StepOne™，StepOne Plus™等 |
2. 使用注意
① 因Mix中预混有染料，其保存或反应体系配制过程应避免强光照射；
② 使用前上下颠倒轻轻混匀Mix，请勿涡旋振荡混匀，避免产生过多气泡。
③ 可在首次试验前根据“适配机型”表格内容选择合适的ROX Dye一次性加入Mix管内。加入终浓度为2×（1 mL mix加入20 μL ROX Dye）。
3. 建议的qPCR反应体系
| 试剂 | 使用量 | 终浓度 |
| 化学热启动染料法荧光定量PCR预混液（独立ROX） | 10 μL | 1× |
| 正向引物（10 μM）a | 0.4 μL | 0.2 μM |
| 反向引物（10 μM）a | 0.4 μL | 0.2 μM |
| ROX（依据机型选择） | 0.2 μL | 1× |
| DNA模板b | X μL | 10~200 ng/20 μL |
| Nuclease-Free Water | To 20 μL |
a．通常推荐的引物终浓度为0.2 μM，反应效果不佳时可在0.1~1 μM范围内进行调整；
b．推荐模板加样量为1~2 μL，如模板类型为未稀释cDNA原液，模板添加量不应超过总反应体系的10%。不同种类DNA模板中含有的靶基因拷贝数目不同，必要时可进行梯度稀释，以确定最佳的DNA模板添加量。
4. qPCR参数设置（可根据机型适当调整）
两步法
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环 |
| 预变性 | 95℃ | 10 min | / |
| 变性 | 95℃ | 10 s | 40 Cycles |
| 退火 & 延伸a | 60℃ | 30 s | |
| 熔解曲线b | 使用仪器默认采集程序 | / |
三步法
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环 |
| 预变性 | 95℃ | 10 min | / |
| 变性 | 95℃ | 15 s | 40 Cycles |
| 退火a | 55~65℃ | 15 s | |
| 延伸a | 72℃ | 30 s | |
| 熔解曲线b | 使用仪器默认采集程序 | / |
a．根据引物的Tm值进行退火（退火&延伸）温度的设定；若扩增片段在200 bp以内，延伸（退火&延伸）时间可以设置为15 s；此外，延伸时间的设置还需根据您使用的qPCR仪所需要的数据采集最短时间限制自行调整；
b．不同qPCR仪的熔解曲线采集程序有差别，一般可使用仪器默认的熔解曲线采集程序。
5. 实验优化
若使用默认反应条件反应性能不佳时，则需要进行反应条件的优化，可以从引物浓度以及扩增程序两个方面进行：
① 引物浓度调整
当引物终浓度在0.1~1.0 μM范围之间变化时，引物浓度越低，扩增特异性越高，但扩增效率会有所下降。
② 扩增程序优化
需提高扩增特异性，可使用两步法程序或提高退火温度；需提高扩增效率，可使用三步法程序或延长延伸时间。
6. 引物设计原则
① 扩增产物长度建议控制在80~200 bp；
② 引物长度为18~25 bp；
③ 正向引物和反向引物的Tm值相差不超过1℃为佳，Tm值控制在58~62℃为佳；
④ 引物的GC含量控制在40%~60%之间；
⑤ 引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避开T/C或者A/G的连续结构（特别是3'端）；
⑥ 引物3'端最后一个碱基最好为G或者C；
⑦ 避开引物内部或者两条引物之间的互补序列；
⑧ 使用NCBI BLAST功能检索确认引物的特异性。
常见问题及解决办法
1. 扩增曲线不光滑
① 荧光信号太弱，经系统校正后产生
确保Mix中预混的染料未降解；更换荧光信号收集更好的qPCR专用耗材。
2. 扩增曲线断裂或下滑
① 模板浓度较高，基线的终点值大于Ct值
减小基线终点（Ct值-4），重新分析数据。
3. 个别孔扩增曲线突然骤降
① 反应管内留有气泡
确保Mix完全溶解，请勿涡旋振荡混匀；加样完成后轻弹离心去除气泡；延长预变性时间至10 min，以去除气泡。
4. 反应结束无扩增曲线出现
① 反应循环数偏少
设置循环数为40，但更多的循环数会增加过多的背景信号；
② 荧光信号采集步骤未设置或者设置错误
两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火&延伸阶段，三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段；
③ 引物可能降解
长期未用的引物，应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除其降解的可能；
④ 模板浓度过低
减少模板稀释倍数重复实验，样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起；
⑤ 模板降解
重新制备模板，重复实验；
5. Ct值出现过晚
① 扩增效率低
提高引物浓度，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物；
② 模板浓度过低
减少模板稀释倍数重复实验，样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起；
③ 模板降解
重新制备模板，重复实验；
④ 扩增产物过长
扩增产物长度控制在80~200 bp；
⑤ 体系中存在PCR抑制剂
一般为模板带入，加大模板稀释倍数或重新制备纯度高的模板重复实验；
6. 空白对照出现信号
① 反应体系污染
首先更换空白对照的水，如果还发生同样情况，继续更换引物、吸头、管或启用新的Mix PCR；反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染；
② 出现引物二聚体等非特异性扩增
一般在35循环以后空白对照出现扩增产物属正常情况，应配合熔解曲线进行分析；重新设计引物，调整引物浓度或优化PCR反应程序；
7. 熔解曲线出现多峰
① 引物设计不佳
根据引物设计原则重新设计新引物；
② 引物浓度过高
适当降低引物浓度；
③ cDNA模板存在基因组污染
提取后的RNA溶液使用DNA酶进行消化，例如：dsDNase，以去除基因组污染，或设计跨内含子引物；
8. 实验重复性差
① 加样误差大
使用精准的移液器、配合高品质吸头准确移液；高倍稀释模板，加入大体积模板减少加样误差；放大qPCR反应体积；
② 模板浓度过低
减少模板稀释倍数重复实验；
③ qPCR仪不同位置的温度偏差
定期校准qPCR仪。
