化学热启动染料法荧光定量 PCR 预混液（无 ROX）是 SYBR GreenI嵌合染料法专用qPCR 试剂，为 2×预混液，包含除引物和 DNA 样品以外的所有 qPCR 组分，可减少操作步骤， 缩短加样时间，降低污染几率。其核心组分是经化学法修饰的热启动 Taq DNA 聚合酶，配合精心优化的 Buffer 体系，有效抑制非特异性扩增，可对宽广浓度范围的模板进行准确定量，获得稳定可靠的 qPCR 结果。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| 化学热启动染料法荧光定量 PCR预混液（无 ROX） |
HSM030031 | 5×1 mL |
使用说明
1.适配机型
| Rox 含量 | 适用机型 |
| NoneROX | Bio-Rad CFX 全系列； Roche LightCycler™ 系列； Eppendorf Mastercycler® ep realplex 系列； Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 系列； Takara Thermal Cycler Dice； analytikjena qTOWER 系列等。 |
| LowROX | ABI 7500/7500 Fast，ABI ViiA 7™； ABI QuantStudio™ 系列； Stratagene Mx3000P®/3005P™/4000™ |
| HighROX | ABI 7000/7300/7700/7900 HT/7900 HT Fast， StepOne™，StepOne Plus™等 |
2. 使用注意
① 因 Mix 中预混有染料，其保存或反应体系配制过程应避免强光照射；
② 使用前上下颠倒轻轻混匀 Mix，请勿涡旋振荡混匀，避免产生过多气泡。
3. 建议的 qPCR 反应体
| 试剂 | 系使用量 | 终浓度 |
| 化学热启动染料法荧光定量 PCR预混液（无ROX） |
10μL | 1× |
| 正向引物 (10 μM)a | 0.4μL | 0.2 μM |
| 反向引物 (10 μM)a | 0.4μL | 0.2 μM |
| DNA 模板b | XμL | 10~200ng/20μL |
| Nuclease-Free Water | To 20μL |
a．通常推荐的引物终浓度为 0.2 μM，反应效果不佳时可在 0.1~1 μM 范围内进行调整；
b．推荐模板加样量为 1~2 μL，如模板类型为未稀释 cDNA 原液，模板添加量不应超过总反应体系的 10%。不同种类 DNA 模板中含有的靶基因拷贝数目不同，必要时可进行梯度稀释，以确定最佳的 DNA 模板添加量。
4. qPCR 参数设置（可根据机型适当调整）
两步法
| 步骤 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 95℃ | 10min |
| 变性 | 95℃ | 10s |
| 退火 & 延伸a | 60℃ | 30s |
| 熔解曲线b | 使用仪器默认采集程序 | |
三步法
| 步骤 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 95℃ | 10min |
| 变性 | 95℃ | 15s |
| 退火a | 55~65℃ | 15s |
| 延伸a | 72℃ | 30s |
| 熔解曲线b | 使用仪器默认采集程序 | |
a．根据引物的 Tm 值进行退火（退火&延伸） 温度的设定；若扩增片段在 200bp 以内，延伸（退火&延伸）时间可以设置为 15 s；此外， 延伸时间的设置还需根据您使用的 qPCR 仪所需要的数据采集最短时间限制自行调整;
b．不同 qPCR 仪的熔解曲线采集程序有差别， 一般可使用仪器默认的熔解曲线采集程序。
5.实验优化
若使用默认反应条件反应性能不佳时，则需要进行反应条件的优化，可以从引物浓度以及扩增程序两个方面进行：
①引物浓度调整
当引物终浓度在 0.1~1.0 μM 范围之间变化时，引物浓度越低,扩增特异性越高，但扩增效率会有所下降。
②扩增程序优化
需提高扩增特异性，可使用两步法程序或提高退火温度；需提高扩增效率，可使用三步法程序或延长延伸时间。
6.引物设计原则
① 扩增产物长度建议控制在 80~200 bp;
②引物长度为 18~25bp;
③ 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不超过 1°C 为佳，Tm 值控制在 58~62℃为佳；
④引物的 GC 含量控制在 40%~60%之间;
⑤ 引物 A、G、C、T 整体分布尽量要均匀， 避开 T/C 或者 A/G 的连续结构（特别是 3' 端）；
⑥引物 3'端最后一个碱基最好为 G 或者 C;
⑦避开引物内部或者两条引物之间的互补序列;
⑧使用 NCBI BLAST 功能检索确认引物的特异性。
常见问题及解决办法
1.扩增曲线不光滑
①荧光信号太弱，经系统校正后产生确保 Mix 中预混的染料未降解；更换荧光信号收集更好的 qPCR 专用耗材。
2.扩增曲线断裂或下滑
①模板浓度较高，基线的终点值大于 Ct 值减小基线终点 (Ct值-4)， 重新分析数据。
3.个别孔扩增曲线突然骤降
①反应管内留有气泡确保 Mix 完全溶解，请勿涡旋振荡混匀；加样完成后轻弹离心去除气泡；延长预变性时间至 10 min，以去除气泡。
4.反应结束无扩增曲线出现
①反应循环数偏少
设置循环数为 40，但更多的循环数会增加过多的背景信号；
②荧光信号采集步骤未设置或者设置错误
两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火 & 延伸阶段，三步法扩增程序应当将信号采集设置在 72℃延伸阶段；
③引物可能降解
长期未用的引物，应先通过 PAGE 电泳检测完整性，以排除其降解的可能；
④模板浓度过低
减少模板稀释倍数重复实验，样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起；
⑤模板降解
重新制备模板，重复实验；
5.Ct 值出现过晚
①扩增效率低
提高引物浓度，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物；
②模板浓度过低
减少模板稀释倍数重复实验，样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起；
③模板降解
重新制备模板，重复实验；
④扩增产物过长
扩增产物长度控制在 80~200 bp；
⑤体系中存在 PCR 抑制剂
一般为模板带入，加大模板稀释倍数或重新制备纯度高的模板重复实验；
6.空白对照出现信号
①反应体系污染
首先更换空白对照的水，如果还发生同样情况， 继续更换引物、吸头、管或启用新的 MixPCR； 反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染；
②出现引物二聚体等非特异性扩增
一般在 35 循环以后空白对照出现扩增产物属正常情况，应配合熔解曲线进行分析；重新设计引物，调整引物浓度或优化 PCR 反应程序；
7.熔解曲线出现多峰
①引物设计不佳
根据引物设计原则重新设计新引物；
②引物浓度过高
适当降低引物浓度；
③cDNA 模板存在基因组污染
提取后的 RNA 溶液使用 DNA 酶进行消化， 例如：dsDNase，以去除基因组污染，或设计跨内含子引物；
8.实验重复性差
①加样误差大
使用精准的移液器、配合高品质吸头准确移液； 高倍稀释模板，加入大体积模板减少加样误差； 放大 qPCR 反应体积；
②模板浓度过低
减少模板稀释倍数重复实验；
③qPCR 仪不同位置的温度偏差定期校准 qPCR 仪。
