产品概述
One-Step Multiplex RT-qPCR Master Mix(TWO TUBE) 是以 RNA 为模板的一种多重荧光定量 PCR， 适用于以 RNA 为模板的单重或多重定量 PCR 检测。在反应过程中，逆转录和定量 PCR 在一管内完成， 简化了实验操作。本产品使用 UDG-dUTP 防污染措施，能有效防止扩增产物气溶胶污染的风险。 本产品可兼容快速程序，可缩短检测时间。
产品组成
| 货号 | 组分 | 100rxn | 1000rxn | 5000rxn |
| HMD6906A | PCR Buffer | 1.2 mL×1管 | 12 mL×1管 | 12 mL×5管 |
| HMD6906B | Enzyme Mix | 0.4 mL×1管 | 4 mL×1管 | 4 mL×5管 |
运输及保存方法
≤0℃运输；-25℃~-15℃保存。
反应体系
反应液按下表配置：
| 组分 | 体积 |
| PCR Buffer | 12 μL |
| Enzyme Mix | 4 μL |
| Primer Forward（10 μM） | 0.4 μL |
| Primer Reverse（10 μM） | 0.4 μL |
| TaqMan Probe（10 μM） | 0.2 μL |
| 模板 RNA | 1 pg-1 μg |
| RNase Free H2O | to 25 μLa |
a. 推荐反应体系 25 μL，其余扩增体系可按比例调整。
注：1. 引物终浓度通常为 0.2 μM，当扩增性能较差时，可根据情况在 0.1-1.0 μM 范围内进行。
2. 可以使用含有多个荧光信号的探针，每种不同信号的探针终浓度可在 50-300 nM 之间调整。
3. qPCR 灵敏度极高，推荐将模板进行稀释后加入反应体系中，控制 Ct 值范围在 20-35 之间适宜。
4. 使用前请充分溶解后吸取，避免剧烈震荡产生过多气泡。
5. 模板加入后，八联管需混匀离心后即可上机。
扩增程序
标准反应程序：
| 步骤 | 温度 | 时间 |
| 反转录 | 55℃ | 15min |
| 预变性 | 95℃ | 1min |
| 循环 45× | 95℃ | 10s |
| 60℃ | 30s |
快速反应程序：
| 步骤 | 温度 | 时间 |
| 反转录 | 55℃ | 5min |
| 预变性 | 95℃ | 1min |
| 循环 42× | 95℃ | 5s |
| 60℃ | 15s |
注：1. 实际使用的 Real Time PCR 仪是否支持快速扩增循环，初次尝试请进行预实验确认。
2. 扩增反应温度可根据引物 Tm 值进行调整。
3. 具体扩增程序可根据检测项目具体引物探针进行调整，初次尝试请进行预实验确认。
注意事项
1. 在实验过程中请使用 RNase free 耗材。
2. 引物设计相关建议/要求：
| 类别 | 建议/要求 |
| 长度 | 18-30 个碱基较为合适； |
| GC 含量 | 40-60% |
| Tm 值 |
1. 常规引物设计软件均可以给出 Tm 值（推荐使用 Oligo 7）； 2. 简单的 Tm 值计算公式为：Tm=4℃×（G+C）+2℃×（A+T）； 3. 建议正向和反向引物 Tm 值尽量接近； 4. 建议引物设计 Tm 值在 55-60℃内，提高退火温度可以增加 PCR 试剂的特异性。 |
| 引物设计 |
1. 建议 PCR 扩增产物长度在 70-200bp 之间； 2. 尽量避免在模板的二级结构区域内设计引物； 3. 避免正向和反向引物 3’ 端形成 2 个或以上的互补碱基以减少引物二聚的形成； 4. 引物 3’ 端不能有多于 3 个连续的 G 或者 C，引物 3’ 端末端碱基不能为 T； 5. 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构； |
3. 探针设计相关建议/要求：
| 类别 | 建议/要求 |
| 长度 | 18-30 个碱基较为合适 |
| 探针设计 |
1. 探针建议使用 HPLC 级别以上纯化，否则残留的未结合荧光染料会造成荧光本底升高从而降低检测的灵敏度； 2. 探针 5’ 端应避免使用碱基 G； 3. 探针建议 Tm 值在 65-70℃； 4. 如探针中含有突变，尽量控制在两端，不要在探针中部存在突变。 5. 探针尽量不要存在二级结构，如必须有，须控制探针 Loop 环 Tm 值＜40℃。 |
