本试剂盒用于定量检测样本中全能核酸酶的含量。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| 全能核酸酶检测试剂盒 2.0（ELISA 法） | HBP000116 | 96T/盒 |
检测原理
本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫检测（夹心ELISA）原理，酶标板微孔中包被抗全能核酸酶抗体，加入样本后孵育洗涤，然后加入生物素（Biotin）标记的抗全能核酸酶抗体孵育洗涤，最后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素（SA-HRP）孵育，形成抗体+抗原+抗体-Biotin+SA-HRP 复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色，TMB 在 HRP 的催化下转化成蓝色，经酸的终止作用转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中全能核酸酶含量呈正相关,用酶标仪测定吸光度（OD 值）后可根据标准曲线计算样品中全能核酸酶的浓度。
试剂盒组成
1.反应板………………………………8×12孔
2.检测抗体（100×）……………..0.15mL×1
3.酶结合物（1000×）………………15μL×1
4.稀释液……………………………50mL×1
5.显色剂……………………………12mL×1
6.终止液………………………………6mL×1
7.浓缩洗涤液（10×）………………60mL×1
8.浓缩标准品………………………0.1mL×1
9.封板膜……………………………………4 张
10.说明书…………………………………1 份
储存条件及有效期
1、2~8℃储存 12 个月。
2、开封后需在 6 周内用完。
所需仪器
1、酶标仪（含 450nm 波长滤光片，建议含有双波长检测模式，主副波长分别为 450nm和 650nm）。
2、微孔板振荡器（400-600rpm）。
检测流程图
试剂准备
使用前所有试剂组分以及待测样本需要平衡至室温（23°C±2℃）。
1、10×浓缩洗涤液与纯化水按 1：9 体积比混合成洗涤工作液。
2、100×检测抗体使用前可 7000rpm 离心20s，然后用稀释液稀释 100 倍后使用。
3、1000×酶结合物使用前可 7000rpm 离心20s，然后用稀释液稀释 1000 倍后使用。
4、浓缩标准品（1000ng/mL）用稀释液稀释至 2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL、
0.125ng/mL、0.063ng/mL、0.031ng/mL、 0ng/mL，稀释方法建议如下：
| 编号 | 终浓度（ng/mL） | 稀释方法 | |
|---|---|---|---|
| 稀释液 | 工作标准品加量 | ||
| A | 2 | 0.998mL | 2μL 浓缩标准品 |
| B | 1 | 0.5mL | 0.5mL A 溶液 |
| C | 0.5 | 0.5mL | 0.5mL B 溶液 |
| D | 0.25 | 0.5mL | 0.5mL C 溶液 |
| E | 0.125 | 0.5mL | 0.5mL D 溶液 |
| F | 0.063 | 0.5mL | 0.5mL E 溶液 |
| G | 0.031 | 0.5mL | 0.5mL F 溶液 |
| H | 0 | 0.5mL | / |
检测步骤
1. 从室温平衡后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回 2~8℃。
2. 设置标准品孔和样本孔，建议所有标准品和待测样本进行双复孔测定，标准品孔各加入不同浓度的标准品 100μL，样本孔中加入待测样本 100μL。
3. 用封板膜封住反应孔，室温下振板（500rpm）反应 60min。
4. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（300μL），静置 15~30s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 5 次。
5. 标准品孔和样本孔中每孔加入工作浓度的检测抗体 100μL，用封板膜封住反应孔，室温下振板（500rpm）反应 30min。
6. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（300μL），静置 15~30s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 5 次。
7. 标准品孔和样本孔中每孔加入工作浓度的酶结合物 100μL，用封板膜封住反应孔，室温下振板（500rpm）反应 30min。
8. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（300μL），静置 15~30s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 5 次。
9. 每孔加入显色剂 100uL，用封板膜封住反应孔，室温静置避光反应 30min。
10. 每孔加入终止液 50μL，15min 内进行检测，设定酶标仪测定波长为 450nm（建议用双波长 450nm/650nm）。
检测结果的解释
1、取标准品、空白对照、样本的平均光吸收值，减去空白对照的平均光吸收值，得到标准品、样品的光吸收校准值。以标准品浓度为横坐标，校准后的标准品光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。（双波长检测模式下的光吸收值为450nm 减去 650nm）
2、多种绘图和统计学软件可以用于辅助绘制标准曲线并进行未知样本浓度的计算。三次曲线拟合法往往曲线拟合效果较好，但其它方法如 Logistic（4P）也可能获得较好拟合结果，需要根据具体实验数据进行分析。
检测性能
1. 检出限：0.01 ng/mL
2. 检测低限：0.02 ng/mL
3. 线性范围：0.02~2 ng/mL
4. 精密度：批内变异系数≤10%，批间变异系数≤15%
5. 回收率：80%~120%
6. 特异性：本试剂盒搭配瀚海新酶全能核酸酶使用，也可用于其他厂家全能核酸酶的检测，但应该使用相应的产品建立标准曲线。
注意事项
1. 显色温度和时间对实验结果至关重要，应准确把握。
2. 洗涤过程中应使洗涤液浸泡反应板15~30s 后再甩干，以充分洗涤非特异性吸附的成分。
3. 所有试剂使用前应充分摇匀，加样时应将所加样物加入酶标板孔中底部，避免加在孔壁上部，加样时注意不可溅出，不可产生气泡。
4. 若发现浓缩洗涤液中有结晶，可在 37℃水浴锅中孵育，待结晶完全溶解后再混匀稀释至工作浓度。
5. 样本中应避免引入叠氮钠（NaN3），叠氮钠会破坏辣根过氧化物酶活性，使检测值偏低。
