本文提供了用于 N-糖快速酶释放和快速标记的 N-糖分析试剂盒的常规维护和使用信息。本方案使用单克隆抗体进行了验证，并且已经过测试，适用于多种其它 N-联糖蛋白。我们建议用户对自己特定样品的酶释放进行确认。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| N-糖分析试剂盒 | HBP003101 | 24 个样/盒 |
| HBP003102 | 96 个样/盒 |
产品性质
| 模块 | 组分 | HBP003101 |
|---|---|---|
| 糖基释放模块 HBP003101-1 | IgG | 1.2 mg |
| PNGase F酶 | 45µL | |
| PNGase F缓冲液 | 0.5mL | |
| 表面活性剂 | 1.2mg*6 | |
| 标记模块 HBP003101-2 | 标记物 | 8.2mg*3 |
| 无水DMF | 1mL | |
| 纯化模块 HBP003101-3 | 96孔提取板 | 1块 |
| 洗脱缓冲液 | 5mL*1 | |
| 样本稀释液 | 5mL*1 | |
| 收集模块 HBP003101-4 | 8连排反应管 (200μL） | 100个 |
| 8连盖 | 100个 | |
| 收集板(96孔) | 1个 | |
| 废液盘 | 1个 |
| 模块 | 组分 | HBP003102 |
|---|---|---|
| 糖基释放模块 HBP003102-1 | IgG | 5 mg |
| PNGase F酶 | 150µL | |
| PNGase F缓冲液 | 1 mL | |
| 表面活性剂 | 3.6mg*8 | |
| 标记模块 HBP003102-2 | 标记物 | 24.6mg*4 |
| 无水DMF | 1mL | |
| 纯化模块 HBP003102-3 | 96孔提取板 | 1块 |
| 洗脱缓冲液 | 5mL*4 | |
| 样本稀释液 | 5mL*4 | |
| 收集模块 HBP003102-4 | 8连排反应管 (200μL） | 100个 |
| 8连盖 | 100个 | |
| 收集板(96孔) | 1个 | |
| 废液盘 | 1个 |
使用说明
在启动本方案之前，用户需自备如下试剂和设备(以 1 个 IgG（I4506）样本为例)：
（1） 0.85%氯化钠溶液 100µL；乙腈（LCMS 级）；超纯水；
（2） 15/85=超纯水/乙腈溶液(v/v),2mL； 1/9/90=甲酸/超纯水/乙腈(v/v)，20mL； 50 mM 甲酸铵，pH=4.4，500mL；
（3） SPE 真空泵； 96 孔板负压装置或正压装置；加热模块或金属浴（90℃和 50℃）；涡旋仪；移液枪。
第一步：快速糖基释放
（1）称取 IgG 样品粉末于 0.85%氯化钠溶液或超纯水中，使得 IgG 终浓度 2mg/mL（此处为推荐浓度，可根据实际样本情况调整浓度）。
（2）糖基释放缓冲液：溶解 1 瓶表面活性剂（1.2mg/3.6mg）于(24μL/72μL)的PNGase F 缓冲液中，混匀室温放置（该缓冲液现配现用）。
（3）取 20μL IgG 溶液加入 200μL 反应管中，加入 3μL 糖基释放缓冲液，吸打混匀后，再加入 3.3μL 超纯水，抽吸和分散使其混匀。
（4）将上述混合物于加热模块中 90℃，3 min，使其变性，取出，置室温冷却 3min。
（5）再加入 1.2μL PNGase F，抽吸和分散使其混匀，于加热模块中 50℃孵育该混合物5min。在此等候过程中，可配制标记试剂。
（6）反应完成后取出，室温冷却 3min。
第二步：快速标记糖基
（1）标记试剂：溶解 1 瓶标记物（8.2mg/24.6mg）于(60.13μL/180.4μL)无水 DMF 中，该标记试剂现配现用）,抽吸和分散溶液 5-10 次，以完全溶解。
（2）向反应管内加入 6 μL 标记试剂溶液，抽吸和分散 5 次确保混匀，室温下反应5min。
（3）加入 179 μL 乙腈，混匀用于纯化。
第三步：纯化
（1）安装负压或正压装置及 96 孔提取板。
（2）活化：用 200μL 超纯水加入要使用的孔进行活化，废液盘收集。
（3）平衡：用 200μL 15/85 的水/乙腈溶液对孔进行平衡，废液盘收集。
（4）上样：加载乙腈稀释的样品，废液盘收集。
（5）用 600μL 的 1/9/90 的甲酸/超纯水/乙腈对孔进行清洗两次至废液盘。
（6）取走废液盘，更换为收集板。
（7）用 50μL 的洗脱缓冲液加入小孔，洗脱糖基至收集板，洗脱 2 次。
（8）加入 200μL（建议量，具体可根据样本，检测设备等进行调整）的样本稀释液，混匀，待上机检测。
第四步：HILIC-FLR 检测分析
（1）色谱柱 ACQUITY UPLC® Glycan BEH Amide, 130 Å, 1.7 μm, 2.1 x 150 mm(waters 部件号 186004742)。
（2）柱温： 60 °C。
（3）流动相 A：50 mM 甲酸铵（推荐使用LC-MS 级)溶液，pH=4.4。
（4）流动相 B：100%乙腈（推荐使用 LC-MS 级)。
（5）流速： 0.4 mL/min；
（6）梯度：
| 时间（min） | 流速(mL/min) | %A | %B | 曲线 |
| 0 | 0.4 | 25 | 75 | 6 |
| 35 | 0.4 | 46 | 54 | 6 |
| 36.5 | 0.2 | 100 | 0 | 6 |
| 39.5 | 0.2 | 100 | 0 | 6 |
| 43.1 | 0.2 | 25 | 75 | 6 |
| 47.6 | 0.4 | 25 | 75 | 6 |
| 55 | 0.4 | 25 | 75 | 6 |
（7）FLR 波长： EX 265/EM 425 nm；
（8）FLR 采样速率： 2 Hz，
（9）进样体积： 10μL（建议量，具体可根据样本，检测设备等进行调整）。备注：以上参数基于配备“ACQUITY® RDa”检测器的 LCMS，用户根据设备调整适当的参数。
运输及保存方法
| 名称 | 保存条件 |
|---|---|
| IgG | 2-8℃，12个月 |
| PNGase F | -25～-15℃，12 个月，避免反复冻融 |
| PNGase F缓冲液 | 2-8℃，12个月 |
| 表面活性剂 | 常温，12个月 |
| 标记物 | 2-8℃，12个月，避光 |
| 无水DMF | 常温，12个月 |
| 洗脱缓冲液 | 常温，12个月 |
| 样本稀释液 | 常温，12个月 |
| 96孔提取板 | 常温至效期末，一旦打开，未使用的孔用封口膜密封，放置干燥环境中 |
| 200μL 8连排反应管、8连盖、96孔收集板、废液盘 | 常温至效期末，96 孔收集板密封干燥保存。 |
注意事项
• 对于中间产物体系中含有柠檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐、 Tris、SDS；或体系 pH＜4 或 pH＞9，使用本试剂盒时，若出现轻微沉淀影响测值情况下，建议对样本体系进行溶液置换。
• 置换操作流程：（以下建议基于实验设备：DLAB，型号：D1624R，因设备、耗材、样本不同，可根据实际情况调整，比如时间、转速等）
（1）准备 10kD 的超滤离心管，加入 150μL 超纯水， ≥13000rpm 离心 5 分钟（若发现超滤管残留体积较大，该超滤管异常，及时更换新的超滤管重复此操作）。
（2）取300μL样本溶液至10kD过滤管中12000rpm离心3min，去掉下层液体，向上层截留溶液中加入300 μL超纯水12000rpm 离心3min，再重复两次，吸取全部上层截留溶液至离心管中（或为了将液体转移干净，可将内管倒置于新的外管，12000rpm 离心3min）（可测试蛋白浓度，并调整至合适浓度，进行N-糖的测试）。
• 或提高转速按如下操作：
（1）准备 10kD 的超滤离心管，加入 150μL 超纯水， ≥13000rpm 离心5min（若发现超滤管残留体积较大，该超滤管异常，及时更换新的超滤管重复此操作）。
（2）取300μL样本溶液至10kD过滤管中14000rpm离心2min，去掉下层液体，向上层截留溶液中加入400 μL超纯水14000rpm 离心2min，再重复一次，吸取全部上层截留溶液至离心管中（或为了将液体转移干净，可将内管倒置于新的外管，14000rpm 离心2min）（可测试蛋白浓度，并调整至合适浓度，进行N-糖的测试）。
• 为了您的安全健康，请穿实验服并佩戴手套操作。
• 每次取用时请使用洁净的移液枪头。
• 请按照说明书保存和使用相关试剂。
• 纯化模块中含有乙腈，易燃，有毒，使用时需严格遵守安全规范，应当由经过培训、有能力处理此类物质的专业实验室人员使用，产品的安全使用完全由采购方和用户负责。建议（1）通风：操作需在通风橱或充分排风的场所进行，避免蒸气积聚；（2）个人防护：需要佩戴防毒面具、化学防护眼镜等；（3）远离明火、热源及氧化剂（如过氯酸盐），储存温度≤30℃，相对湿度≤80%，与酸类、碱类、易燃物隔离存放；
（4）泄漏应急处理：小量泄漏应用活性炭吸附或用大量水冲洗，废水需专业处理；（5）避免皮肤接触，若出现恶心、呕吐、胸闷、抽搐，需立即就医。
