本试剂盒采用双抗体夹心法原理，并偶联生物素-链霉亲和素系统，用于定量检测样本中双链RNA(dsRNA)含量，检测的 dsRNA长度40bp 及以上, 检测的 dsRNA与其核酸序列无关。酶标板微孔中包被抗dsRNA抗体，加入样本后孵育洗涤，再加入生物素化检测抗体孵育，形成抗体-抗原-抗体复合物，再次洗涤后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素(streptavidin，SA）。经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，经酸的终止作用转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中dsRNA含量呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值)，根据标准曲线计算样品中 dsRNA浓度。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| dsRNA定量检测试剂盒 | HBP003802 | 48T |
| HBP003803 | 96T |
产品性质
本试剂盒用于定量检测样本中 dsRNA 的含量。
运输及保存方法
1. 试剂盒于 2~8℃ 储存，避免强光直射，有效期 12个月。
2. 包被条拆封使用后，应将剩余包被条密封，在2~8℃ 储存，在有效期内使用。
3. 试剂盒其他组分使用后要及时放回到 2~8℃ 条件，在有效期内使用。
试剂盒组成
| 组分 | HBP003802 | HBP003803 | |
|---|---|---|---|
| 1 | 反应板 | 8×6 孔 | 8×12 孔 |
| 2 | 生物素化检测抗体(100x) | 60μL | 120μL |
| 3 | HRP- 链霉亲和素(100x) | 60μL | 120μL |
| 4 | 稀释液 | 15mL | 30mL |
| 5 | 显色剂 | 6mL | 12mL |
| 6 | 终止液 | 3mL | 6mL |
| 7 | 浓缩洗涤液 (20x) | 20mL | 40mL |
| 8 | dsRNA 标准品 ( 无修饰 ,1ng/μL) | 15μL | 30μL |
| 9 | dsRNA 标准品(pUTP 修饰 ,1ng/μL) | 15μL | 30μL |
| 10 | dsRNA 标准品(N1-Me-pUTP 修饰 , 1ng/μL) | 15μL | 30μL |
| 11 | dsRNA 标准品(5-OMe-UTP 修饰 , 1ng/μL) | 15μL | 30μL |
| 12 | STE buffer | 25mL | 50mL |
| 13 | 封板膜 | 2 张 | 4 张 |
| 14 | 说明书和 COA | 各 1 份 | 各 1 份 |
所需仪器和试剂
1. 酶标仪 ( 含 450nm 波长，建议含有双波长检测模式，主副波长分别为 450nm 和 650nm)。
2. 微孔板摇床
3. RNase-free 枪头和 EP 管
检测流程图
实验前准备
1. 将本次实验所用试剂平衡至室温 (18-25℃)
2. 20× 浓缩洗涤液用纯化水按 1： 19 体积比稀释成洗涤工作液。
3. 将抗体管、 HRP-SA 管和标准品管 1000rpm 在使用前离心 30s，以避免管壁及管盖上残留试剂。
4. 将 100× 生物素化检测抗体和 100×HRP- 链霉亲和素在使用前用稀释液作 100 倍稀释后使用。
5. 无修饰 dsRNA 标准品用 STE buffer 稀释至 1、 0.5、
0.25、 0.125、 0.0625、 0.0312、 0.0156pg/μL。 pUTP 修饰 dsRNA 标准品用 STE buffer 稀释至 0.5、
0.25、 0.125、 0.0625、 0.0312、 0.0156、 0.0078pg/μL。 N1-Me-pUTP 修饰 dsRNA 标准品用 STE buffer 稀释至 1.5、 0.75、 0.375、 0.187、 0.093、 0.047、 0.023pg/μL。 5-OMe-UTP 修饰 dsRNA 标准品用 STE buffer 稀释至 2、 1、 0.5、 0.25、 0.125、 0.0625、 0.0312pg/μL。
稀释方法建议如下：
检测步骤
1. 从室温平衡后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条加盖封板膜后用自封袋密封放回 2~8℃。
2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加入不同浓度的标准品 100μL，样本孔中加入待测样本 100μL。
* 当不能够确定待测样品中的 dsRNA 含量时，应当用 STE buffer 做多个稀释倍数做检测，以免含量过高不能够读取有效数值。
3. 用封板膜封住反应孔，室温下振板 (500rpm) 反应60min。
4. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(250μL)，静置 30s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 4 次。
5. 标准品孔和样本孔中每孔加入工作浓度的生物素化检测抗体 100μL，用封板膜封住反应孔，室温下振板 (500rpm) 反应 60min。
6. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(250μL)，静置 30s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 4 次。
7. 标准品孔和样本孔中每孔加入工作浓度的 HRP-链霉亲和素 100μL，用封板膜封住反应孔，室温下振板 (500rpm）反应 30min。
8. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(250μL)，静置 30s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 4 次。
9. 每孔加入单组分底物显色液 100μL，用封板膜封住反应孔，室温静置避光反应 30min。
10. 每孔加入终止液 50μL，立即进行检测，设定酶标仪波长于 450nm 处 ( 建议用双波长 450nm/650nm）。
检测结果的解释
1. 取标准品、空白对照、样本的平均光吸收值，减去空白对照的平均光吸收值，得到标准品、样品的光吸收校准值。以标准品浓度为横坐标，校准后的标准品光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。双波长检 (测模式下的光吸收值为 450nm 减去 650nm）
2. 推荐使用专业的曲线制作软件，如 curve expert
1.3 或 ELISA Calc ( 请使用 Logistic 五参数或四参数拟合曲线计算方法绘制标准曲线 ) 等。
检测性能
1. 检出限：无修饰、 pUTP 修饰、 N1-Me-pUTP 修饰 dsRNA 检出限 ≤0.001pg/μL， 5-OMe-UTP 修饰 dsRNA 检出限≤0.01pg/μL。
2. 定量限：无修饰 dsRNA 定量限 0.0156pg/μL， pUTP 修饰dsRNA 定量限 0.0078pg/μL， N1-Me-pUTP 修饰dsRNA 定量限 0.023pg/μL， 5-OMe-UTP 修饰 dsRNA定量限 0.0312pg/μL。
3. 精密度：板内变异系数 ≤10%，板间变异系数 ≤10%
4. 回收率： 80%~120%
5. 线性范围：无修饰 dsRNA 检测线性范围 0.0156-0.25pg/μL， pUTP 修饰 dsRNA 检测线性范围
0.0078-0.25pg/μL， ,N1-Me-pUTP 修饰 dsRNA 检测线性范围 0.023-0.375pg/μL， 5-OMe-UTP 修饰dsRNA 检测线性范围 0.0312-0.5pg/μL。
注意事项
1. 显色温度和时间对实验结果至关重要，应准确把握。若出现按常规操作流程，测值超出仪器可检测范围现象，可适当减少显色时间。
2. 洗涤过程中应使洗涤液浸泡反应板 30s 后再甩干，以充分洗涤非特异性吸附的成分。
3. 所有试剂使用前应充分摇匀，加样时应将所加样物加入酶标板孔中底部，避免加在孔壁上部，加样时注意不可溅出，不可产生气泡。
4. 若发现浓缩洗涤液中有结晶，可在 37℃ 水浴锅中孵育，待结晶完全溶解后再混匀稀释至工作浓度。
5. 样本中应避免引入叠氮化钠 (NaN3），叠氮化钠会破坏辣根过氧化酶活性，使检测值偏低。
6. 实验操作过程中要严格避免 RNase 污染。
7. 不可使用摇床代替振板机，若无振板机可采用室温静置孵育，但静置孵育会造成检测灵敏度下降一倍左右。建议无修饰标准品从 2pg/μL 开始稀释， pUTP 修饰标准品从 1pg/μL 开始稀释， N1-Me-pUTP修饰标准品从 3pg/μL 开始稀释， 5-OMe-UTP 修饰标准品从 4pg/μL 开始稀释， HRP-SA 孵育时长由30min 调整至 60min。
检测实例
1. 标曲测值
| 抗原浓度(pg/μL) | N1-Me-pUTP 修饰标准品 | ||
|---|---|---|---|
| OD450-OD650(1) | OD450-OD650(2) | AVERAGE | |
| 1.5 | 3.5318 | 3.5017 | 3.5168 |
| 0.75 | 2.6444 | 2.6594 | 2.6519 |
| 0.375 | 1.8339 | 1.8643 | 1.8491 |
| 0.187 | 1.0725 | 1.0771 | 1.0748 |
| 0.093 | 0.6176 | 0.6369 | 0.6273 |
| 0.046 | 0.3188 | 0.3203 | 0.3196 |
| 0.023 | 0.1766 | 0.1791 | 0.1779 |
| 0 | 0.0177 | 0.0171 | 0.0174 |
2. 标曲五参数 Logistic 曲线拟合
3. 线性范围判断： 0.023-0.375pg/μL
4. 样品测值
| 上样浓度 | OD450-OD650 | dsRNA 浓度( 代入标曲 ) | 结果判断 | |
|---|---|---|---|---|
| eGFP | 1ng/μL | 1.7647 | 0.3587 | 有效 |
| 0.4ng/μL | 0.8998 | 0.1448 | 有效 | |
| 0.2ng/μL | 0.4778 | 0.0701 | 有效 | |
| Fluc | 4ng/μL | 1.7403 | 0.3511 | 有效 |
| 1.6ng/μL | 0.8286 | 0.1312 | 有效 | |
| 0.8ng/μL | 0.4534 | 0.0662 | 有效 |
