N-糖分析试剂盒(2-AB) - 催化生命智造未来-瀚海新酶

本方案提供用于 N-糖蛋白中糖基释放，并用2-AB(2-氨基苯甲酰胺)进行衍生化标记的操作方法和使用信息。本方案使用单克隆抗体进行了验证，建议用户根据需要进行优化。

产品信息

产品名称	货号	规格
N-糖分析试剂盒（2-AB法）	HBP003106	50T
N-糖分析试剂盒（2-AB法）	HBP003107	100T

在启动本方案之前，用户需自备如下试剂和设备：

（1）乙腈（LCMS 级）；20%甲酸（v/v）；

（2）50 mM 甲酸铵，pH=4.4；

（3）磁力架（200µL 或 1.5mL）；

（4）加热模块或金属浴（50℃）；

（5）涡旋仪；移液枪。

如下以 1 个 IgG 样本（货号：I4506）为例：

一、糖基释放模块

1、称量 IgG，用超纯水溶解混匀，使得终浓度为 5mg/mL（此处为推荐浓度，可根据实际样本情况调整浓度）。

2、取出糖型纯化用磁珠，震荡混匀后取出200µL 加入 200µL PCR 管中（或者 1.5mL 离心管），置于磁力架，静止澄清后，小心吸弃上清，去掉磁力架。

3、取 20µL IgG 溶液加入上述反应管中（建议沿磁珠所在侧上方缓慢加入），同样方法，加入 4µL 酶切缓冲液，2µL PNGaseF，轻微涡旋混匀，使得液体全部在管底，50℃ 孵育10min，取出后冷却至室温。

二、标记模块

4、标记工作液制备：分别取 2-AB 溶液，标记用还原剂溶液，20%甲酸按 1:1:1（v/v/v）混合，即为标记工作液。

5、取 25µL 标记工作液加入上述反应管，涡旋混匀后于 65℃孵育 15min。

三、纯化模块

6、取 330µL 乙腈加入标记完成后的样本中，涡旋混匀后，置于磁力架，静止澄清后，小心吸弃上清，去掉磁力架。

7、取 400µL 洗液加入上述反应管，轻微涡旋混匀后，置于磁力架，静止澄清后，小心吸弃上清，去掉磁力架。重复此步骤操作一次。

8、在磁珠上方，沿磁珠方向加入 30µL 洗脱液（建议量，可根据实际样本，检测设备等进行调整），轻微涡旋混匀后孵育 3min，置于磁力架，静止澄清后，小心取上清于另一干净反应管中。

9、取 50µL 稀释液（建议量，可根据实际样本，检测设备等进行调整）加入上述干净反应管中，并混匀，待上机检测（也可使用过滤管对样本进行过滤，取滤液进行上机检测）。

第四步：HILIC-FLR 检测分析

（1）色谱柱 ACQUITYUPLC® GlycanBEH Amide, 130 Å,1.7 μm, 2.1 x150 mm(waters 部件号 186004742)。

（2）柱温： 60 °C。

（3）流动相 A：50 mM 甲酸铵（推荐使用LC-MS 级)溶液，pH=4.4。

（4）流动相 B：100%乙腈（推荐使用 LC-MS级)。

（5）流速： 0.4 mL/min；

（6）梯度：

（7）FLR 波长： EX 330/EM 420 nm；

（8）FLR 采样速率： 2 Hz；

（9）进样体积： 10μL（建议量，可根据实际样本，检测设备等进行调整）。备注：以上参数基于配备“ACQUITY® RDa”检测器的 LCMS，用户根据设备调整适当的参数。

• 为了您的安全健康，请穿实验服并佩戴手套操作。

• 每次取用时请使用洁净的移液枪头。

• 请按照说明书保存和使用相关试剂。

• 纯化模块中含有乙腈，易燃，有毒，使用时需严格遵守安全规范，应当由经过培训、有能力处理此类物质的专业实验室人员使用，产品的安全使用完全由采购方和用户负责。建议：

（1）通风：操作需在通风橱或充分排风的场所进行，避免蒸气积聚；

（2）个人防护：需要佩戴防毒面具、化学防护眼镜等；

（3）远离明火、热源及氧化剂（如过氯酸盐），储存温度≤30℃，相对湿度≤80%，与酸类、碱类、易燃物隔离存放；

（4）泄漏应急处理：小量泄漏应用活性炭吸附或用大量水冲洗，废水需专业处理；

（5）避免皮肤接触，若出现恶心、呕吐、胸闷、抽搐，需立即就医。