宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒适用于生物制品样本中残留 DNA 检测的样本前处理，可稳定高效地获得微量细胞 DNA。本试剂盒适用于多种基质缓冲溶液，可与各种宿主细胞(CHO、E.coli、Vero、酵母、NS0、Human、 MDCK、Sf9&AcNPV、Hi5&AcNPV、质粒、 SV40LTA&EIA)的宿主残留DNA检测试剂盒配合使用。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| 宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒(磁珠法) | HBP003610-1 | 48T |
| HBP003610-2 | 200T |
产品组分
| 试剂盒A | 48T | 200T |
| 裂解液REL | 5.5mL | 40mL |
| 裂解结合液CLB | 24mL | 90mL |
| 洗涤液DW1 | 30mL | 110mL |
| 洗涤液DW2 | 60mL | 110mL*2 |
| 洗脱液DE | 5.5mL | 22mL |
| 试剂盒B | 48T | 200T |
| 蛋白酶K | 0.55mL | 1.1mL*2 |
| 糖原 | 0.5mL | 1mL*2 |
| 酵母tRNA | 0.33mL | 1.33mL |
| 试剂盒C | 48T | 200T |
| 磁珠MXVB | 1.1mL | 1.1mL*4 |
运输及保存方法
试剂盒 A: 10~30℃保存，有效期 12 个月。试剂盒 B：-25~-15℃保存，有效期 12 个月。试剂盒 C:2~8℃保存，有效期 12 个月。
所需耗材与设备
恒温加热装置、离心机、涡旋振荡器、超净台、磁力架、Nuclease-free 离心管、Nuclease-free 枪头。
样本准备
1. 生物制品纯化过程中的中间样本(可能DNA 含量较高）
1.1 先稀释后纯化：使用 1×PBS(pH 7.4，无Mg 2+ 和Ca 2+ )进行适当稀释后再进行样本纯化处理。
1.2 先纯化后稀释：对样本纯化后再使用 1x PBS 进行稀释处理。
1.3 为了保证样本的检测值在标准曲线线性范围之内，建议将 DNA 含量高样本稀释 100倍或 1000 倍。如果样本经过了稀释，则使用稀释液作为阴性对照。
2. 干粉样本(选其一)
2.1 样本溶解及纯化：使用稀释液将干粉样本进行溶解后进行样本纯化处理。
2.2 样本溶解稀释及纯化：用适当的稀释液将干粉样本溶解，制备成高浓度溶液，使用稀释液稀释后进行样本纯化处理。
2.3 建议将干粉样本稀释成 10mg/mL 或100mg/mL。
3.pH 过高或过低样本
3.1 一般情况下生物制品纯化过程的中间样本的 pH 值为中性，若样本的 pH 过酸或过碱，会影响样本纯化处理效果。
3.2 调节 pH：样本处理前先测试一下样本pH 值，使用 1M HCl/NaOH 调节 pH 至中性(pH6.0~8.0），再进行纯化操作。
4. 对照样本处理
4.1 样本平行处理：为了确保结果的准确性，建议每个样本进行三次 DNA 提取处理和检测。
4.2 阴性对照(NTC）：每次实验中都需设置阴性对照，NTC 与其他待测样本一起进行前处理，以检测在样本处理过程中是否存在交叉污染或环境污染。
4.3 加标回收(ERC)：使用 ERC 来评估 DNA提取的效率、回收率和准确度，并可用 ERC 来评估验证分析方法和系统性能。样本 DNA 加标量设定在其无加标测试值的 2~10 倍为宜。
实验步骤
1. 试剂准备：检查试剂盒中溶液是否有沉淀，磁珠取出后室温平衡 10min。 2．取 100μL 待测样本于离心管中，加入 100 μL 裂解液 REL、10μL 蛋白酶 K，涡旋混匀10s，离心后于 60℃孵育 40 分钟。（若蛋白浓度较高≥100mg/mL，可调整加入200μL裂解液 REL、20μL 蛋白酶 K，孵育 60 分钟且孵育期间每隔 15 分钟涡旋混匀）
3. 孵育完成后，瞬时离心，加入 400μL 裂解结合液 CLB、9μL 糖原、6μL 酵母 tRNA 和 20 μL 磁珠 MXVB，振荡 7~10 分钟使磁珠吸附DNA。(若孵育消化加入 200μL 裂解液 REL 和20μL 蛋白酶 K，则裂解结合液 CLB 调整为加入 500μL）
4. 离心管置于磁力架，静置数分钟至溶液澄清，吸弃溶液。
5. 加入 500μL 洗涤液 DW1，涡旋 10s 后置于磁力架至溶液澄清，吸弃溶液。
6. 加入 500μL 洗涤液 DW2，涡旋 10s 后置于磁力架至溶液澄清，吸弃溶液。
7. 再次加入 500μL 洗涤液 DW2，涡旋 10 秒后置于磁力架至溶液澄清，吸弃溶液。
8.充分吸弃剩余液体，打开管盖，空气干燥3~5分钟。注意：乙醇残留会抑制后续反应；切勿干燥过久以免影响后续洗脱效果。
9. 加入 100μL 洗脱液 DE，涡旋 30s 后置于60℃孵育 5 分钟，离心后转移至磁力架上至溶液澄清。
10. 吸取上清液至新的离心管中。如短期保存请置于-25~-15℃保存，如长期保存请置于-70℃或更低的温度。
注意事项
1. 本试剂盒中的多种缓冲液含有刺激性的胍盐，务必戴上手套，并按照安全标准预防措施来处理。不要让缓冲液接触到皮肤、眼睛以及黏膜，如果确实发生，请立即用大量清水清洗并就医。
2. 如因气温较低，溶液出现沉淀，需要 30℃水浴至沉淀完全溶解后方可使用。
3. 如因气温较低，裂解液 REL 出现沉淀，可60℃水浴至沉淀完全溶解后使用。
4. 如果提取酵母 DNA，则不需要加酵母 tRNA。
注意要点
1.DNA 洗涤和洗脱操作时，每次振荡混匀后，都应瞬时离心，以保证没有磁珠或液体附着于离心管盖或管壁上，再转至磁力架进行磁分离。
2. 在每一步加液和弃液操作时，大拇指轻轻地打开管盖，避免指肚碰触管盖下环圈产生污染，吸取溶液时注意勿将液体溅出。
3. 在磁力架上分离磁珠时，中途可以适当旋转离心管，使磁珠吸附更加集中。
4. 在去除乙醇干燥时，观察磁珠状态，勿让磁珠干燥过久，以免洗脱时不完全溶解。
5. 请尽量在完成样本纯化处理当天进行后续的 DNA 检测，以保证检测结果的准确性。
| 常见问题 | 可能原因 | 解决方案 |
| 纯化回收 | 样本蛋白含量高 | 可相应增加蛋白酶K用量和消化时间 |
| 率低 | 洗涤过程中磁珠有损失 | 洗涤过程中如发现磁珠吸附位置太过靠近管底，可轻柔吹打几次，使管底磁珠往上吸附 |
| 样本pH值过低 | 调节样本pH到中性范围 | |
| 洗脱液与磁珠未能充分混匀 | 将已加入洗脱液的离心管置于涡旋振荡器上振荡，使磁珠从管壁上脱落且与洗脱液混匀；如操作后磁珠仍附着于管壁，可将离心管60℃温浴2分钟后振荡或涡旋，直至磁珠与洗脱液混匀 | |
| 回收结果不稳定 | 磁珠保存于-18℃及以下导致磁珠性能下降 | 在2~8℃保存磁珠 |
| 加标不准确或洗脱液体积吸取不准确 | 定期校准移液枪，保证移液枪准确度；使用低吸附和带滤芯枪头 | |
| 洗脱后纯化液中残留磁珠 | 可重复离心一次，吸取上清 |
