SpCas9-NLS 是一种 RNA 介导的核酸内切酶，来源于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)。该酶可在 crRNA 和 tracrRNA(或两者连接形成的 sgRNA)引导下，识别双链 DNA 靶标中 PAM 序列(5′-NGG)上游与 sgRNA spacer 序列互补的位置，并在 PAM 上游第 3 个碱基前端切割 DNA 双链。
SpCas9-NLS 常用于基因编辑，为提高细胞内编辑效率，本品 N 端带有猴病毒 40(SV40)T 抗原核定位序列(NLS)。本品亦可用于体外靶标 DNA 的剪切和基因克隆等。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 包装规格 |
| SpCas9-NLS蛋白 | HSM060161-01 | 100pmol |
| HSM060161-02 | 1000pmol |
产品组分
| 组分 | HSM060161-01 | HSM060161-02 |
| SpCas9-NLS(10 μM) | 10μL | 100μL |
| 10×CutBuffer C | 1mL | 1mL |
失活条件
85℃温浴 5min。
质量控制
蛋白纯度：使用 SDS-PAGE 凝胶电泳检测，蛋白纯度不低于 95%。
非特异性内切酶活性：将 10pmol SpCas9-NLS 与 200ng 超螺旋质粒 DNA 在 37℃温育 4h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，少于 10%的质粒 DNA 转变成缺刻或线性状态。
DNase 活性：将 10pmol SpCas9-NLS 与 15ng 双链 DNA 片段在 37℃温育 16h，使用琼脂糖凝胶电泳检测双链 DNA 底物无变化。
RNase 活性：将 10pmol SpCas9-NLS 与 500ng 总 RNA 在 37℃温育 1h，使用琼脂糖凝胶电泳检测超过 90%的 RNA 仍保持完整。
使用方法
体外顺式切割实验
1. 在冰上配制如下反应体系
| 试剂 | 使用量 | 终浓度 |
| 10×CutBuffer C | 2μL | 1× |
| SpCas9-NLS(10 μM)a | 0.5μL | 250nM |
| sgRNA(10 μM)a,b | 0.5μL | 250nM |
| Target DNA(1μM)a | 0.5μL | 25nM |
| Nuclease-free water | Up to 20μL | - |
a. 如果用凝胶电泳检测切割产物，建议 Target DNA 用量为 100~500ng，长度在 300bp~3kb 之间。建议 SpCas9-NLS:sgRNA:Target DNA 的摩尔比为 10:10:1，尽量确保靶标 DNA 被完全切割。
b. sgRNA 可参考以下序列设计：
5′-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGAAAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUG-3′
（下划线表示 Target DNA 特异性互补配对的 spacer 序列)。
2. 37℃反应 30min~1h 后，85℃孵育 5min 灭活；
3. 使用琼脂糖凝胶电泳检测产物。
常见问题
| 问题描述 | 原因 | 解决方法 |
| 观察到目的 DNA 切割不完全 | SpCas9 Nuclease、gRNA、target DNA 的比例不合适 | 推荐 SpCas9 Nuclease、gRNA、target DNA 的摩尔比例至少为 10:10:1，也可以通过适当延长反应时间使反应更加充分 |
| 与 gRNA 的序列有关 | 根据 target DNA 选择更合适的 gRNA 序列，不同的 gRNA 的效果会差别比较大 | |
| gRNA降解 | 通过凝胶电泳验证 gRNA 的完整性 | |
| 反应缓冲液不合适 | 请使用 SpCas9 NLS 自带的缓冲液 10×CutBuffer C | |
| 不同的 gRNA 之间的消化效率存在差异 | gRNA的序列设计 | 设计的 gRNA 需要进行序列与模板的验证 |
| gRNA的质量 | 利用琼脂糖凝胶电泳验证 gRNA 的完整性 |
