AarI 属于 Type IIS 型限制酶，是 PaqCI 的完全同裂酶，识别 CACCTGC 序列并在其下游进行切割，形成 4 碱基的 5'突出。不同于常规的 Type IIS 限制酶，AarI 酶切需要两个或两个以上识别位点，搭配随酶附赠的激活剂可实现完全酶切，在没有激活剂的情况下可以酶切，但无法酶切完全。AarI 的识别序列长达 7 碱基，在基因中的出现频率较低，尤其适合用于 Golden Gate 组装。
同裂酶：PaqCI
注：同裂酶对于不同的甲基化修饰可能具有不同敏感性。
图标注释
最适反应温度为 37℃
对于被 CpG 甲基化的 DNA，剪切可能受阻
失活条件为 80℃温育 20 min
3 h 温育未表现星号活性，更长时间酶切可能出现星号活性
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 包装规格 |
|---|---|---|
| AarI | HSM052031 | 100 U |
产品组分
| 组分 | 规格 |
|---|---|
| AarI (5 U/μL) | 20 μL |
| AarI Activator | 20 μL |
| 10× CutFlex Buffer | 1 mL |
| 10× CutFlex Color Buffer | 1 mL |
活性定义
1 活性单位（U）是指在激活剂存在下，50 μL 反应体系中，37℃ 1 h 内完全酶切 1 μg λDNA 所需的酶量。
运输及保存方法
-25~-15℃运输与保存，有效期 2 年。
建议反应条件
1. 1× CutFlex Buffer；
2. 37℃温育；
3. 参照“DNA 酶切流程”配制反应体系。
失活条件
80℃温育 20 min。
质量控制
功能活性检测：37℃下，5 U AarI 能够在 1 h 内完全消化 1 μg p615 DNA。
超长时间温育检测：37℃下，将 5 U AarI 与 1 μg p615 DNA 共同温育 3 h，未检测到其他核酸酶污染或星号活性引起的底物非特异性降解。延时酶切可能出现星号活性。
酶切-连接-再酶切检测：37℃下，使用 5 U AarI 消化底物，回收酶切产物。在 22℃下使用适量 T4 DNA Ligase (Fast)可以将超过 95%的酶切产物重新连接。将连接产物再次回收后，使用相同的内切酶可以重新切开约 95%以上的连接产物。
使用方法
1. DNA 酶切流程
1) 在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系：
| 组分 | 用量 |
|---|---|
| ddH2O | Up to 50 μL |
| 10× CutFlex Buffer or 10× CutFlex Color Buffer | 5 μL |
| 底物 DNAa | 1 μg |
| AarI (5 U/μL) | 1 μL |
| AarI Activatorb | 1 μL |
| Total | 50 μL |
a. DNA 底物中应不含苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、洗涤剂或高浓度盐，否则将会影响 AarI 酶活性。
b. AarI 完全酶切需要按 1:1 的比例加入和酶体积一致的激活剂，激活剂在电泳时表现为几十 bp 左右的条带，请避免误判为非特异性切割。
2) 轻柔吸打或轻弹管壁以混匀（切勿涡旋），然后瞬时离心以收集挂壁液滴；
3) 37℃温育 1~3 h；
4) 80℃温育 20 min 即可使酶失活，停止反应，或者通过吸附柱或苯酚/氯仿纯化终止反应。
2. 注意事项
1) AarI 是 PaqCI 的完全同裂酶；
2) AarI 完全酶切需要两个或两个以上识别位点；
3) 反应体系中加入的酶体积不应超过总体积的 10%，避免酶中过多的甘油引起星号活性；
4) 限制性内切酶存储缓冲液中的添加剂（例如甘油、盐）与底物溶液中的污染物（例如盐、EDTA 或乙醇等）相同，反应体积越小，酶切反应抑制效应越强。
不同 DNA 中的酶切位点数量
| DNA | 酶切位点数量 |
|---|---|
| λDNA | 12 |
| ΦX174 | 0 |
| pBR322 | 0 |
| pUC57 | 0 |
| pUC18/19 | 0 |
| SV40 | 0 |
| M13mp18/19 | 0 |
| Adeno2 | 9 |
甲基化修饰影响
| Dam | Dcm | CpG | EcoKI | EcoBI |
|---|---|---|---|---|
| 无影响 | 无影响 | 剪切受影响 | 无影响 | 无影响 |
在不同反应缓冲液中的活性
| CutFlex Buffer | Thermo Scientific FastDigest Buffer | NEB rCutSmart™ Buffer | Takara QuickCut™ Buffer |
|---|---|---|---|
| 100% | <12.5% | 100% | <12.5% |
注：活性数据来自瀚海限制酶标准反应体系下的检测。
