本试剂盒为 Annexin V 与 PI 联合使用的试剂盒，用于检测细胞凋亡早期的发生，可区分凋亡早期凋亡细胞和晚期凋亡或坏死细胞。
Annexin V 为胞内蛋白膜联蛋白家族成员，以钙离子依赖的方式选择性与磷脂酰丝氨酸(PS)结合。PS 正常分布在细胞膜内侧。PS 外翻到细胞膜外是不同类型的细胞在凋亡早期的明显特征，用带有 FITC 标记的 Annexin V，即 Annexin V-FITC，可通过流式细胞仪或荧光显微镜检测到这一重要特征。FITC 呈现黄绿色荧光。
PI（Propidium Iodide, 碘化丙啶）是一种可对 DNA 染色的细胞核染色试剂，在嵌入 DNA 后释放红色荧光。PI 不能穿透完整的细胞膜，但可以穿透坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞。
Annexin V-FITC 与 PI 联合使用时，PI 被排除在活细胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被 FITC 和 PI 结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。
FITC 最大吸收波长和激发波长分别为 494nm 和 518nm，PI-DNA 复合物的最大吸收和发射波长分别为 535nm 和 617nm。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒 | HSC030011 | 100T |
产品组分
| 产品组成 | 包装规格 |
|---|---|
| Annexin V-FITC | 500μL |
| Propidium iodide | 1mL |
| Binding Buffer(1×) | 50mL×2 |
运输与保存方法
冰袋运输。2~8℃避光保存，有效期 24 个月。
【注】：不可冷冻！
使用方法
下列实验方案以利用星形孢菌素诱导 Jurkat 细胞凋亡为例，如果使用其他诱导剂和其他类型的细胞，实验条件需要略作调整。
1. 流式细胞检测
（1）根据实验要求诱导细胞凋亡。检测样品中应包含未经处理的细胞样品，作为阴性对照。此外，建议设定一组样品做单染，用于调节补偿。
（2）收集细胞。
悬浮细胞：300g，4℃离心 5min 收集细胞；
贴壁细胞：用不含 EDTA 的胰酶消化后 300g，4℃离心 5min 收集细胞，胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。
【注】：用胰蛋白酶消化然后使细胞在最佳细胞培养条件和培养基中恢复约 30min，然后再染色。胰蛋白酶消化会暂时破坏质膜，允许 Annexin V 结合磷脂酰丝氨酸在细胞膜的细胞质表面上，从而导致假阳性染色。
（3）用预冷的 PBS 洗涤细胞两次，每次均在 300g，4℃下离心 5min，收集 1-5×105个细胞并用 100μL 1×结合缓冲液重悬细胞。
（4）每管加入 4-5μL 的 FITC-Annexin V 和 5μL 的 PI 工作液。
【注】：我们推荐准备两管额外的流式管，每管只加入一种单染染料（FITC-Annexin V 和 PI），用于流式单染的补偿调节。
（5）室温避光孵育 10-15 min，为避免影响细胞凋亡进程，孵育过程可在冰上操作。
（6）每管加入 400μL 的 PBS 或 1×结合缓冲液，尽快通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
FITC-Annexin V 可以由 488nm 激光激发，检测荧光发射光谱约在 530nm 处（FITC 通道），PI 通道发射光谱约在 617nm 处。
【注】：PBS 或 1×结合缓冲液的选择根据不同凋亡处理以及不同细胞具体选择。
2. 荧光显微镜检测
对于悬浮细胞，可参照流式细胞检测的方法进行具体操作。
（1）在盖玻片或载玻片小室中接种细胞。
（2）根据实验要求诱导细胞凋亡。检测样品中应包含未经处理的细胞样品，作为阴性对照。
（3）用 PBS 洗涤细胞。
【注】：细胞收集后如果不用 PB 清洗，可以用含血清的培养基直接替代 Annexin V 结合缓冲液，但是 Annexin V 的使用浓度需要重新优化。
（4）每 100μL 的 Annexin V 结合缓冲液中加入 5-25μL 的 FITC-Annexin V 和 5μL 的 PI。
【注】：最佳使用浓度由具体实验要求确定。
（5）向培养板中加入足量的染液以覆盖全部细胞，室温避光孵育 15-30 min。为避免影响细胞凋亡进程，孵育过程可在冰上操作，但孵育时间至少延长至 30 min。
（6）用 1×结合缓冲液清洗细胞。
（7）将孵育有细胞的盖玻片置于载玻片上，载玻片可提前加一滴 1×结合缓冲液；对于培养在小室内的细胞，可直接加入足量的 1×结合缓冲液覆盖细胞。
（8）使用合适的滤光片在荧光显微镜下观察细胞。FITC-Annexin V 可用 FITC 适用的滤光片，PI 可用 Cy3 或者 Texas。
注意事项
1. 本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
2. 荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
