让唾液酸修饰程度“看得见”：混合模式分离高唾液酸N-糖

糖基化：生物药研发中的关键质量属性

糖基化是治疗性蛋白药物中最重要的翻译后修饰之一，对药物的稳定性、药代动力学、生物活性等均有影响[1]。其中，唾液酸N-糖在生物药中发挥着多重关键作用：它通过避免被受体识别，从而影响药物半衰期及药代动力学[2]；另外，其修饰程度和连接方式（如α2,3与α2,6）影响抗体的效应功能（如ADCC、抗炎活性）及Fc段结构稳定性[3]。

因此，唾液酸N-糖的组成与修饰水平是影响生物药药效、安全性和质量一致性的核心质量属性，也是高唾液酸生物药（如促红素）糖基化表征与工艺控制的重要指标。

离子交换+亲水作用混合模式：让高唾液酸糖链“各归其位”

标记后的糖链采用离子交换和亲水作用混合模式分离。其中，离子交换模式依据糖链所带电荷数进行分离——唾液酸修饰程度越高，负电荷越多，与固定相结合越强；亲水模式则对电荷数相同的 N-糖链按极性和分子大小进一步分离。该分离模式可直观反映糖链的唾液酸修饰程度。相较于单抗糖链分析中常用的 HILIC 亲水模式，这种阴离子交换与亲水混合模式更适用于观察唾液酸的修饰程度[4]。

根据2025年版《中国药典》的最新要求，针对高唾液酸N-糖的分析新增了第四法及第五法，旨在更全面地评估N-糖的考察范围，从而提升对糖基化修饰的检测覆盖能力和质量控制水平[5]。

*下方性能测试除方法学比对外，均采用促红素（EPO）系统适用性对照品。

（一）良好的专属性

空白制备溶液在阳性样品出峰位置无干扰峰出现，表明试剂盒具有良好的专属性。

图1：专属性图谱

（二）优异的制备重复性及中间精密度

2名实验人员按照本试剂盒方法，各平行制备6份供试品溶液，上机进行测试。各峰簇测试结果表明该方法具有良好的重复性。

测试结果：

①峰面积CV不高于5.30%，中间精密度不高于4.18%；

②峰面积百分比CV不高于2.44%，中间精密度不高于1.99%；

③保留时间CV不高于0.41%，中间精密度不高于0.30%；

④Z值CV不高于0.12%。

表1：各峰簇峰面积（Area）CV统计

表2：各峰簇峰面积百分比（Area%）CV统计

表3：主峰保留时间（Time/min）CV统计

表4：Z值CV统计

图2：Area%精密度统计图

图3：保留时间精密度统计图

图4：重复性叠图

（三）样本耐用性测试

按方法制备EPO样本3个重复，放置于进样器24h及48h，计算与0h的各峰簇保留时间和相对峰面积百分比以及峰面积的差异。时间差异：|△T|=|A-B|，相对峰面积百分比及峰面积差异计算公式：（D）/%＝(D-C /C）×100%。

与0h样品比较，将样品放置24h和48h后，各峰簇的保留时间差<0.5min，各峰簇的相对峰面积百分比偏差<5%，相对峰面积偏差<12%，结果显示该方法所制备的样品稳定性良好。

表5：保留时间，相对峰面积百分比，峰面积对比结果：

（四）方法学比对

使用促红素系统适用性对照品、厂家①EPO、厂家②EPO、依那西普进行测试，结果与市售试剂盒产品进行比对，计算公式：（D）/%＝(D-C /C）×100%。

结果显示，瀚海新酶试剂盒与市售试剂盒对比，制备不同样本，各峰簇面积百分比最大相对偏差不超过12.56%，表明瀚海新酶方法在不同样本间具有良好的一致性和稳定性，其糖基化分析结果与市售试剂盒高度可比，能够满足N-糖谱分析对重现性和可靠性的要求。

表6：面积百分比相对偏差统计

图5：促红素系统适用性对照品对比图谱

图6：厂家① EPO对比图谱

图7：厂家② EPO对比图谱

图8：依那西普对比图谱

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参考文献

（1）Li H, d'Anjou M. Pharmacological significance of glycosylation in therapeutic proteins. Curr Opin Biotechnol. 2009 Dec;20(6):678-84. doi: 10.1016/j.copbio.2009.10.009. Epub 2009 Nov 4. PMID: 19892545.

（2）Chia S, Tay SJ, Song Z, et al. Enhancing pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of recombinant therapeutic proteins by manipulation of sialic acid content. Biomedicine & Pharmacotherapy = Biomedecine & Pharmacotherapie. 2023 Jul;163:114757. DOI: 10.1016/j.biopha.2023.114757. PMID: 37087980.

（3）Zhang Z, Shah B, Richardson J. Impact of Fc N-glycan sialylation on IgG structure. MAbs. 2019 Nov-Dec;11(8):1381-1390. doi: 10.1080/19420862.2019.1655377. Epub 2019 Sep 2. PMID: 31411531; PMCID: PMC6816437

（4）JCOWPER B, LI X, YU L, et al. Comprehensive glyean analysisof twelve recombinant human erythropoietin preparations frommanufacturers in China and Japan[J]. J Pharm Biomed Anal,2018, 153:214 -220.;

（5）国家药典委员会. 中华人民共和国药典（2025年版）三部[S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2025.

内容丨研发中心、市场部

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图片丨来源于瀚海新酶、网络（侵删）