BbvCI 来源于短芽孢杆菌（Bacillus brevis）（L. Ge）的 BbvCI 基因，经大肠杆菌重组表达获得。BbvCI 属于 Type IIA 类限制酶，以异源二聚体形式存在，由两个不同的催化亚基构成，每个亚基具有独立的切割位点。BbvCI 识别并切割非回文序列 CCTCAGC(-5/-2)，形成 5'端 3 碱基突出的粘性末端。BbvCI 使用 CutFlex 反应缓冲液，可与其他快速限制酶进行双酶切，但不建议长时间酶切（超过 3h），以避免产生星号活性。
图标注释
最适反应温度为 37℃
对于被 CpG 甲基化的 DNA，剪切可能受阻
失活条件为 80℃温育 20min
3h 温育未表现星号活性，更长时间酶切可能出现星号活性
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 包装规格 |
|---|---|---|
| BbvCI | HSM050991 | 50 U |
产品组分
| 组分 | 规格 |
|---|---|
| BbvCI(2 U/μL) | 25 μL |
| 10×CutFlex Buffer | 1 mL |
| 10×CutFlex Color Buffer | 1 mL |
运输及保存方法
-25~-15℃运输与保存。
建议反应条件
1. 1×CutFlex Buffer；
2. 37℃温育；
3. 参照“DNA 酶切流程”配制反应体系。
失活条件
80℃温育 20min。
活性定义
1 活性单位(U)是指在 50μL 反应体系中，37℃ 1h 内完全酶切 1μg λDNA 所需的酶量。
质量控制
功能活性检测：37℃下，2U BbvCI 能够在 15min 内完全消化 1μg λDNA。
超长时间温育检测：37℃下，将 2U BbvCI 与 1μg λDNA 共同温育 3h，未检测到其他核酸酶污染或星号活性引起的底物非特异性降解。延时酶切可能出现星号活性。
酶切-连接-再酶切检测：37℃下，使用 2U BbvCI 消化底物，回收酶切产物。在 22℃下使用适量 T4 DNA 连接酶可以将＜10%的酶切产物重新连接。将连接产物再次回收后，使用相同的内切酶可以重新切开 95%以上连接产物。
使用方法
一、DNA 酶切流程
1. 在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系：
| 试剂 | 用量 |
|---|---|
| ddH2O | Up to 50 μL |
| 10×CutFlex Buffer 或 10×CutFlex Color Buffer | 5 μL |
| 底物 DNAa | 1 μg |
| BbvCI(2 U/μL) | 1 μL |
| Total | 50 μL |
a:DNA 底物中应不含苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、洗涤剂或高浓度盐，否则将会影响 BbvCI 酶活性。
2. 轻柔吸打或轻弹管壁以混匀（切勿涡旋），然后瞬时离心以收集挂壁液滴；
3. 37℃温育 1~3h；
4. 80℃温育 20min 即可使酶失活，停止反应，或者通过吸附柱或苯酚/氯仿纯化终止反应。
二、注意事项
1. 反应体系中加入的酶体积不应超过总体积的 10%，避免酶中过多的甘油引起星号活性；
2. 限制性内切酶存储缓冲液中的添加剂（例如甘油、盐）与底物溶液中的污染物（例如盐、EDTA 或乙醇等）相同，反应体积越小，酶切反应抑制效应越强。
不同 DNA 中的酶切位点数量
| DNA | 酶切位点数量 |
|---|---|
| λDNA | 7 |
| ΦX174 | 3 |
| pBR322 | 0 |
| pUC57 | 0 |
| pUC18/19 | 0 |
| SV40 | 0 |
| M13mp18/19 | 2 |
| Adeno2 | 9 |
甲基化修饰影响
| Dam | Dcm | CpG | EcoKI | EcoBI |
|---|---|---|---|---|
| 无影响 | 无影响 | 剪切受阻 | 无影响 | 无影响 |
在不同反应缓冲液中的活性
| CutFlex Buffer | Thermo Scientific FastDigest Buffer | NEB rCutSmart™ Buffer | Takara QuickCut™ Buffer |
|---|---|---|---|
| 100% | 100% | 100% | 100% |
注：活性数据来自瀚海限制酶标准反应体系下的检测。
