BCA(Bicinchoninic acid)法是目前应用比较广泛的蛋白质浓度测定方法。基于双缩脲反应，即在碱性环境下蛋白质将Cu2+还原成Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，在562nm处有高的吸光值，该反应产物的量与蛋白质浓度成正比。测定其在562nm处的吸光值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。该方法快速灵敏、稳定可靠且对不同种类蛋白质变异系数很小。试剂盒中提供了浓度稳定的蛋白标准品用于制作标准曲线。
BCA蛋白定量试剂盒可用于试管法检测，也可用于微孔板法检测。试管法需较大量蛋白样品(100μL)和工作液(2mL)，蛋白样品与BCA工作液的比率为1:20(v/v)，蛋白质测定范围为20-2000μg/mL，采用加强法可以检测到5μg/mL；微孔板法操作简单方便，仅需少量(10-25μL)的蛋白样品和工作液(200μL)，蛋白样品与工作液的比率为1:20(v/v)或者1:8(v/v），蛋白质测定范围为20-2000μg/mL，采用加强法可以检测到5μg/mL。
我司提供的BCA蛋白浓度检测试剂盒，比色皿法分别可做125次，酶标法可做1250次。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| BCA蛋白定量试剂盒 | HSC070021 | 500T |
产品组分
| 组分 | 规格 |
|---|---|
| BCA试剂A | 100mL |
| BCA试剂B | 5mL |
| BSA标准品2mg/mL | 2×1mL |
运输与保存方法
常温运输。常温保存，有效期12个月。
使用方法
A. 配制标准品和工作液
1. 配制BSA标准品体系（线性范围20-2000μg/mL或者5-250μg/mL标准品制备各2种配置方法，请根据习惯选用恰当方式）。
【注】：BSA标准品浓度为2mg/mL，稀释液为蛋白样品的溶解液，原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用水或1×PBS进行稀释。
BSA标准品体系配制表（配制后可放置于4℃冰箱多次使用）
表1 微孔板检测BSA标准品体系配制（线性范围20-2000μg/mL）配置方法一
| Vial | 稀释液体积(μL) | BSA标准品体积(μL) | BSA终浓度(μg/mL) |
|---|---|---|---|
| A | 0 | 100 | 2000 |
| B | 25 | 75 | 1500 |
| C | 50 | 50 | 1000 |
| D | 83 | 50 | 750 |
| E | 75 | 25 | 500 |
| F | 140 | 20 | 250 |
| G | 150 | 10 | 125 |
| H | 158 | 2 | 25 |
| I | 100 | 0 | 0=Blank |
表2 微孔板检测BSA标准品体系配制（线性范围20-2000μg/mL）配置方法二
| Vial | 稀释液体积(μL) | BSA标准品体积(μL) | BSA终浓度(μg/mL) |
|---|---|---|---|
| A | 0 | BSA标准液100 | 2000 |
| B | 25 | BSA标准液75 | 1500 |
| C | 65 | BSA标准液65 | 1000 |
| D | 35 | VialB35 | 750 |
| E | 65 | VialC65 | 500 |
| F | 65 | VialE65 | 250 |
| G | 65 | VialF65 | 125 |
| H | 80 | VialG20 | 25 |
| I | 80 | 0 | 0=Blank |
表3 BSA标准品体系（微孔板检测，线性范围5-250μg/mL）配置方法一
| Vial | 稀释液体积(μL) | BSA标准品体积(μL) | BSA终浓度(μg/mL) |
|---|---|---|---|
| A | 70 | 10 | 250 |
| B | 75 | 5 | 125 |
| C | 78 | 2 | 50 |
| D | 79 | 1 | 25 |
| E | 399 | 1 | 5 |
| F | 80 | 0 | 0 |
表4 BSA标准品体系（微孔板检测，线性范围5-250μg/mL）配置方法二
| Vial | 稀释液体积(μL) | BSA标准品体积(μL) | BSA终浓度(μg/mL) |
|---|---|---|---|
| A | 70 | BSA标准液10 | 250 |
| B | 40 | VialA40 | 125 |
| C | 45 | VialB30 | 50 |
| D | 40 | VialC40 | 25 |
| E | 40 | VialD10 | 5 |
| F | 40 | 0 | 0 |
2. 配制BCA工作液
（1）计算所需要的总BCA工作液体积。总BCA工作液体积=（标准品数量+待测样品数量）×重复数×每个样品所需要的BCA工作液。【注】：试管法检测时每个样品加2.0mL BCA工作液，微孔板检测每个样品加200μL BCA工作液。
（2）配制BCA工作液：50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂B（A:B=50:1），充分混匀。
【注】：BCA工作液装入密封容器内，室温条件24h稳定。
B. 检测方法
1. 试管检测方法（样品:BCA工作液=1:20）
（1）各取100μL标准品和待测样品加入到反应管中。
（2）每管加入2.0mL BCA工作液，混匀。根据待测样品的浓度范围选择孵育时间和温度。
标准孵育方法：37℃孵育30min或者室温2h（检测范围：20-2000μg/mL）
增强孵育方法：60℃孵育30min（检测范围：5-250μg/mL）
【注】：BCA检测蛋白浓度，延长孵育时间会加深颜色反应。升高温度会加快显色反应，但是温度升高和时间延长会降低检测下限，以及降低工作线性范围。若蛋白浓度很低，可在较高温度孵育或者适当延长孵育时间。
（3）冷却到室温。在分光光度计上进行检测，设定波长为562nm，在10min内对所有样品读数。
【注】：由于BCA反应达不到真正的反应终点，即使温度降低至室温生色反应液会继续。但是，由于室温下生色比率相当低，因此若是10min内能对所有的样本进行562nm吸光度的测试，不会导致明显错误。
（4）根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数），绘制标准曲线（X-蛋白浓度μg/mL；Y-最终的OD 562nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。
2. 微孔板检测方法（样品:BCA工作液=1:20）
（1）各取10μL标准品和待测样品加入到微孔板中。【注】：样品与工作液比例为1:20，检测范围为125-2000μg/mL。若样品浓度非常低，可使用25μL标准品和待检测样品进行检测（即1:8），这时试剂盒的检测范围为20-2000μg/mL。
（2）每孔加入200μL BCA工作液，枪头吹打充分混匀。盖上微孔板，37℃孵育30min。
（3）冷却到室温，在酶标仪上的562nm波长范围处检测吸光度。
（4）根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数），绘制标准曲线（X-蛋白浓度μg/mL；Y-最终的OD 562nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。
注意事项
本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
