CCK-8 试剂盒，是一种基于 WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度的比色检测试剂盒。检测原理为：WST-8 在电子耦合剂 1-Methoxy PMS 存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的水溶性的甲臜（formazan，参考图 1)，生成的甲臜的颜色深浅与细胞增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在 450nm 波长处测定 OD 值，间接反映活细胞数量。
本试剂盒可用于细胞增殖测定，细胞毒性的检测，药物筛选，以及细胞生长抑制检测等。
图 1：WST-8 分子结构及检测原理
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| CCK-8 试剂盒（Cell Counting Kit-8） | HSC040011 | 500T |
运输与保存方法
冰袋运输。2~8℃短期保存，有效期 6 个月；-25~-15℃长期保存，有效期 24 个月。
注：反复冻融会造成测定背景 OD 值升高。
使用方法
1. 以 96 孔板为例，96 孔板中每孔接种 100μL 的细胞悬液，在细胞培养箱预培养 24 h。
2. 向每孔加入 10μL 不同浓度的待测物质。如果仅测定细胞活性，则不需要 2~3 步骤，直接从第四步操作。
3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（依据待测药物而定）。
4. 向每孔加入 10μL CCK-8 溶液（注意不要产生气泡，轻轻混匀）。
5. 将培养板在培养箱内孵育适当时间（一般 0.5~2 h）。
6. 酶标仪测定 450nm 处的吸光值。
细胞活力计算
细胞存活率*（%）=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%
抑制率*（%）=[1-(As-Ab) / (Ac-Ab)]×100%
As: 实验孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8 溶液和药物溶液)；
Ac: 对照孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液，不含药物) ；
Ab: 空白孔吸光度 (含培养基、CCK-8 溶液，不含细胞、药物) 。
注意事项
• 本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
• 建议调试合适的接种细胞的数量和加入 CCK-8 溶液后培养的时间。当使用标准 96 孔板时，贴壁细胞至少 1000 个/孔(100μL 培养基)，白细胞至少 2500 个/孔(100μL 培养基)。建议实验前设定几个不同细胞数量的梯度孔进行条件测试，细胞培养时间和处理方法根据实验情况而定，加入 CCK-8 溶液后（加入体积为每孔细胞培养液体积的 10%），在 37℃细胞培养箱中孵育，不同时间点后测 450 nm 处的吸光值(CCK-8 敏感性高，一些细胞 0.5h 后就可以测定第一次)。
• CCK-8 试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化反应，如果待检测体系中有较多还原剂（或抗氧化剂）会造成背景 OD 值升高，干扰检测结果。如果实验中有还原剂，请检查背景的 OD 值，设法先去除还原剂干扰。例如，可在加入 CCK-8 溶液之前更换新鲜的培养基，以去除待测药物的影响。当待测药物影响比较小时，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入待测药物后的空白吸收即可。
• 进行药物抑制实验时，如果药物中含有金属，如 Pb2+、 Fe2+、 Cu2+等金属会对 CCK-8 Solution 的显色反应产生影响，从而导致检测的灵敏度降低。
• 如果细胞培养时间较长，培养基颜色发生变化，应洗涤细胞更换培养基后再加 CCK-8 检测。细胞培养基酚红不影响测定结果。
• 为使 CCK-8 试剂盒培养基充分混匀，减少 CCK-8 在移液器上的残留，建议加样前用培养基稀释 CCK-8 试剂，混匀后加样。
• 若暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入 0.1M 的 HCL 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，室温避光保存，24h 内检测，吸光度不会受到影响（加入 1% SDS 溶液的体积与加入 CCK-8 溶液的体积相同）。
• 如果吸光值很低，可以适当增加细胞数量或者延长加入 CCK-8 溶液后孵育的时间。
CCK-8 法的优势
| 检测方法 | MTT 法 | XTT 法 | WST-1 法 | CCK-8 法 |
|---|---|---|---|---|
| 产品性状 | 粉末 | 2 瓶溶液 | 溶液 | 1 瓶溶液 |
| 使用方法 | 配成溶液后使用 | 现配现用 | 即开即用 | 即开即用 |
| 检测灵敏度 | 高 | 很高 | 很高 | 高 |
| 检测时间 | 较长 | 较短 | 较短 | 最短 |
| 检测波长 | 560-600nm | 420-480nm | 420-480nm | 430-490nm |
| 细胞毒性 | 高，细胞形态完全消失 | 很低，细胞形态不变 | 很低，细胞形态不变 | 很低，细胞形态不变 |
| 试剂稳定性 | 一般 | 较差 | 一般 | 很好 |
| 批量样品检测 | 可以 | 非常适合 | 非常适合 | 非常适合 |
| 便捷程度 | 一般 | 便捷 | 便捷 | 非常便捷 |
