无细胞蛋白合成试剂盒（二硫键增强版冻干粉）（Cell-Free Protein Synthesis Kit Max (Lyophilized)）是一款基于大肠杆菌细胞裂解液进行体外蛋白质合成的产品。该产品利用细胞裂解液中的核糖体、翻译因子、酶等活性物质，同时补加能量、核苷酸、氨基酸、无机盐等，在体外重构转录-翻译体系。以 DNA 或 RNA 能够快速、灵活地大量表达蛋白质，和传统的重组表达体系相比有众为模板，表达出蛋白质。无细胞蛋白表达是一种不依赖于活菌，能够快速、灵活地大量表达蛋白质，和传统的重组表达体系相比有众多的优势：
1. 蛋白表达快，1~2 h 即可表达出目的蛋白，8~24 h 即可达到最大量。
2. 蛋白表达量高，最高可达到 3 mg/mL 以上的蛋白。
3. 反应简单灵活，仅需向反应体系中加入 DNA 或 RNA 模板，可使用 96 孔板或离心管进行反应。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| 无细胞蛋白合成试剂盒（二硫键增强版冻干粉） | HSM100032-01 | 20T |
| 无细胞蛋白合成试剂盒（二硫键增强版冻干粉） | HSM100032-02 | 100T |
产品组分
| 组分 | HSM100032-01 | HSM100032-02 |
| Cell-free system solution A (Lyophilized) | HSM100022-01A 1瓶(复溶后 300μL) | HSM100032-02A 1管(复溶后 1.5mL) |
| Cell-free system solution B (Lyophilized) | HSM100032-01B 1瓶(复溶后 600μL) | HSM100032-02B 1管(复溶后 3mL) |
| 阳性质粒 | HSM100032-01C (2μg) | HSM100032-02C (2μg) |
操作说明
1.基因构建
目的基因的构建对于蛋白表达至关重要，推荐使用下图的构建方式。可以将目的基因构建到本试剂盒附带的阳性质粒上，即如下的构建方式。
注：含有 lac 乳糖操纵子的质粒（如 pET28a 等）会对产量有较大影响，不建议直接使用。
阳性质粒的 DNA 序列示意图如下所示：
2. 模板制备
无细胞蛋白合成试剂盒可以使用 DNA 或 mRNA 作为模板表达重组蛋白。采用的 DNA 模板可以是质粒，可以是 PCR 产物，也可以是使用 phi29 进行 RCA 滚环扩增的产物。
（1）质粒：基因合成公司直接合成，或进行亚克隆获得用于无细胞蛋白表达的质粒；
（2）PCR 产物：设计引物，正向引物在 T7 启动子上游 200 bp 左右，反向引物在终止密码子下游 200 bp 左右（包含 T7 terminator），对模板进行扩增，获得的 DNA 线性片段可以不经纯化直接投入到无细胞反应体系中。上下游 200bp 碱基的作用是保护 DNA 线性片段不被内源性外切酶降解。
（3）RCA 产物:使用 phi29 聚合酶、随机六引物进行滚环扩增 RCA，获得的 DNA 产物可直接用于无细胞反应体系中。
（4）PCR 和 RCA 可以和 Golden Gate 以及 Gibson Assembly 联用，将极大提高 DNA 模板制备的速度和通量。
3. 无细胞蛋白表达
(1) 分别用 300 μL 和 500 μL 的 RNase Free Water 将冻干粉 Cell-free system solution A 和冻干粉 Cell-free system solution B 复溶（或分别用 1.5 mL 和 2.5 mL 的 RNase Free Water 将冻干粉 Cell-free system solution A 和冻干粉 Cell-free system solution B 复溶），可使用混悬仪或移液器吹打使其完全混合均匀。
(2) 根据反应体系总量计算所需的 A 液和 B 液（体积比 1:2），将所用的试剂于冰上添加到反应容器中（例如 2mL 圆底离心管），并混匀。操作过程需全程佩戴手套、口罩，并采用无酶源的移液器吸头和反应容器，避免引入核酸酶。无细胞反应体系可参照下表进行混合配制：
| 反应体系总量 | 终浓度 | 50μL | 100μL |
| Cell-free system solution A | 30% | 15 μL | 30 μL |
| Cell-free system solution B | 60% | 30 μL | 60 μL |
| 模板 | 5~10 μg/mL | 5~10 μg/mL | 5~10 μg/mL |
| ddH2O | \ | 补足至50 μL | 补足至100 μL |
(2)向反应体系中加入模板 DNA,推荐 DNA 模板的添加终浓度为 5~10μg/mL,可对 DNA 模板添加量进行优化。注意:DNA 模板使用前需要准确定量,基因合成返回的质粒浓度可能偏低，需要确认。
(3)将反应容器放置到普通摇床或恒温混匀仪中，进行无细胞蛋白表达，推荐反应温度为 25~30℃。降低温度会降低蛋白的合成速率，但会增加蛋白的可溶性。一般反应 8h 左右即可达到最大的蛋白产量，也可以过夜反应 16h。当反应温度降低时，应适当增加反应时间。
(4)无细胞蛋白表达需要充足氧气，当使用 2mL 圆底离心管作为反应容器时，反应体系不超过 100μL。无细胞蛋白反应可以等比例放大，放大的反应体系需要使用更大的反应容器，例如摇瓶等，同时保证摇床的转速(200 rpm)。
4.检测
反应结束，取反应液（检测全部蛋白）或反应上清（检测可溶蛋白）1 μL 左右，进行 SDS-PAGE 蛋白凝胶电泳检测目的蛋白的表达。
4.阳性对照
本试剂盒中有绿色荧光蛋白 sf-GFP 质粒作为阳性对照，可通过肉眼直接观测反应结果。sf-GFP 成功表达后,无细胞反应体系将呈现明显的绿色。如需对 sf-GFP 进行精确定量，可使用酶标仪进行检测(Ex/Em=485/528 nm)。
注意事项
• 本货号产品可表达常规蛋白，更适用于表达含二硫键的蛋白。
• 产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
