无细胞蛋白合成试剂盒（Cell-Free Protein Synthesis Kit）是一款基于大肠杆菌细胞裂解液进行体外蛋白质合成的产品。该产品为非天然氨基酸——Nε-crotonyl-L-lysine (Kcr)，能够利用 DNA 序列中的琥珀终止密码子 TAG 向目标蛋白中定向插入 Kcr。试剂盒中包含非天然氨基酸 Kcr、tRNA、氨酰 tRNA 合成酶三种额外成分，可根据客户具体实验进行添加量的优化。本产品可表达含二硫键的蛋白。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| 无细胞蛋白合成试剂盒(非天然氨基酸Kcr版) | HSM100111 | 20 rxn |
产品组分
| 组分 | 规格 |
| Cell-free system solution A | 300 μL |
| Cell-free system solution B | 400 μL |
| CFPS-Control Plasmid | 2 μg |
| Nε-crotonyl-L-lysine Kcr (25×) | 60 μL |
| tRNA (25×) | 60 μL |
| Aminoacyl-tRNA synthetase (50×) | 40 μL |
注：无细胞终反应体积按照 50 μL/rxn 计算。
操作说明
1. 基因构建
(1) 目的基因的构建对于蛋白表达至关重要，推荐使用下图的构建方式。可以将目的基因构建到本试剂盒附带的阳性质粒上，即如图 1 的构建方式；也兼容 pET 9a、pET-23a 等含有 T7 启动子，但不含乳糖操纵子（lac）的 PET 系列质粒。
图 1 目的基因构建示例
注：含有 lac 乳糖操纵子的质粒（如 pET28a 等）会对产量有较大影响，不建议直接使用。
阳性质粒的 DNA 序列示意图如下所示：
图 2 阳性质粒 DNA 序列示意图
2. 模板制备
无细胞蛋白合成试剂盒可以使用 DNA 或 mRNA 作为模板表达重组蛋白。采用的 DNA 模板可以是质粒，可以是 PCR 产物，也可以是使用 phi29 进行 RCA 滚环扩增的产物。
(1) 质粒：通过基因公司合成，或亚克隆获得适用于无细胞反应的质粒，并采用柱纯化方式提取质粒。
(2) PCR 产物：设计引物，正向引物在 T7 启动子上游至少 200bp 左右，反向引物在终止密码子下游至少 200bp 左右（包含 T7 terminator），对模板进行扩增，可以使用 2×HF 高保真预混液（货号:HSM020352），获得的 DNA 线性片段可以不经纯化直接投入到无细胞反应体系中。上下游 200bp 以上碱基的作用是保护 DNA 线性片段不被内源性外切酶降解，扩增引物可使用 F：CAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTAT，R：GCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAG。
(3) RCA 产物：使用 phi29 聚合酶，随机六引物进行滚环扩增 RCA，获得的 DNA 产物可直接用于无细胞反应体系中。
(4) PCR 和 RCA 可以和 Golden Gate 以及 Gibson Assembly 联用，将极大提高 DNA 模板制备的速度和通量。
注：DNA 模板使用前需要准确定量；使用含有单独去蛋白 Wash Buffer 的高纯度质粒提取试剂盒进行质粒提取，避免引入 RNase A；公司返回的质粒需强调使用柱纯化方式，否则不能直接用于无细胞反应；柱法纯化 DNA 模板推荐用无核酸酶水洗脱。
3. 无细胞蛋白表达
(1) 根据反应体系总量计算所需的 A 液和 B 液（体积比 1:2），将所用的试剂于冰上添加到反应容器中（例如 2mL 圆底离心管），并混匀。操作过程需全程佩戴手套、口罩，并采用无酶源的移液器吸头和反应容器，避免引入核酸酶。无细胞反应体系可参照下表进行混合配制：
| 组分 | 终浓度 | 50μL 体系 | 100μL 体系 |
| Cell-free system solution A | 30 % | 15 μL | 30 μL |
| Cell-free system solution B | 40 % | 20 μL | 40 μL |
| 模板 | 5~10 μg/mL | 5~10 μg/mL | 5~10 μg/mL |
| Nε-crotonyl-L-lysine Kcr (25×) | 1× | 2 μL | 4 μL |
| tRNA (25×) | 1× | 2 μL | 4 μL |
| Aminoacyl-tRNA synthetase (50×) | 1× | 1 μL | 2 μL |
| 无核酸酶水 | / | Up to 50 μL | Up to 100 μL |
(2) 向反应体系中加入模板 DNA，推荐 DNA 模板的添加终浓度为 5~10μg/mL，可对 DNA 模板添加量进行优化。
(3) 将反应容器放置到普通摇床或恒温混匀仪中，进行无细胞蛋白表达，推荐反应温度为 25~30℃。降低温度会降低蛋白的合成速率，但会增加蛋白的可溶性。一般反应 8h 左右即可达到最大的蛋白产量，也可以过夜反应 16h。当反应温度降低时，应适当增加反应时间。
(4) 无细胞蛋白表达需要充足氧气，当使用 2mL 圆底离心管作为反应容器时，反应体系不超过 100μL。无细胞蛋白反应可以等比例放大，放大的反应体系需要使用更大的反应容器，例如摇瓶等，同时保证摇床的转速（200rpm）。
4. 检测
反应结束，取反应液（检测全部蛋白）或反应上清（检测可溶蛋白）1μL 左右，进行 SDS-PAGE 蛋白凝胶电泳检测目的蛋白的表达。
5. 阳性对照
本试剂盒中有绿色荧光蛋白 sf-GFP 质粒作为阳性对照，可通过肉眼直接观测反应结果。sf-GFP 成功表达后，无细胞反应体系将呈现明显的绿色。如需对 sf-GFP 进行精确定量，可使用酶标仪进行检测（Ex/Em=485/528nm）。
注意事项
产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
