本产品将 CTAB 提取方法与柱法纯化技术相结合，适合于从各种植物、真菌样品中提取高纯度的 DNA。得到的 DNA 可直接用于 PCR,SSR, AFLP,RAPD, 以及 Southern blot 等实验。试剂盒提供毒性更低的氯仿代替(BufferBDP)，并采用无醇的高浓度胍盐介导过滤纯化，可高效去除样品的多糖多酚等代谢物和RNA。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| 植物DNA提取试剂盒 | HSM010091-01 | 24T |
| HSM010091-02 | 100T |
产品组分
| 组分 | HSM010091-01 | HSM010091-02 | 主要组分 | 组分功能 |
| 纯化次数 | 24次 | 100次 | / | / |
| 纯化柱 B10 | 24个 | 100个 | 玻璃纤维滤膜 | 吸附核酸 |
| 2ml收集管 | 24个 | 100个 | 塑料管 | 收集滤液 |
| Buffer PAL | 20ml | 80ml | Tris、EDTA、NaCl、CTAB | CTAB裂解 |
| Buffer BDP | 20ml | 80ml | 溴氯丙烷/低毒氯仿代替物 | 蛋白变性和增溶 |
| Buffer GWP | 20ml | 110ml | 盐酸胍/醋酸 | 结合液 |
| Buffer DW2 | 6ml | 25ml | Tris/NaCl | 洗涤除盐离子 |
| Elution Buffer | 10ml | 20ml | 10mM Tris, pH8.5 | 洗脱液 |
准备事项
按瓶子标签所示，加入 4 倍体积的无水乙醇稀释 BufferDW2，于室温保存。
实验流程
A. 易提取植物
1. 样品研磨：用液氮把植物/真菌样品研磨成粉末，转移 50~150mg 新鲜/冻藏样品或15~40mg 干燥样品至 2ml 离心管中。
（1）正确使用样品量才能获得理想结果。过量样品会造成柱子堵塞，而引起产量和纯度下降。由于植物样品 DNA 和代谢物质含量差异很大。初次实验时，推荐使用 50mg 新鲜或15mg 干燥样品，根据实验结果再调整样品用量。处理富含粘液质丰富的样品时，建议样品用量不要超过 30~50mg(新鲜)。
（2）扩大样品量：纯化柱 B10 最大结合力为20µg，若样品中 DNA 含量较低，可以扩大 2~3倍样品用量，并按比例加入 Buffer PAL 和BufferBDP，然后过柱纯化时多次过柱。
2. 样品裂解：立即加入 700µl 预热至 65℃BufferPAL 至样品中，剧烈涡旋使样品充分分散，65ºC 水浴 15~30 分钟，期间混匀 2~3 次。实验前加入β-巯基乙醇至 Buffer PAL 至终浓度为 2%，可以提高裂解液的抗氧化能力。由于β-巯基乙醇气味较大，多数样品不需要添加。BufferPAL 为 CTAB 裂解液，更多试剂可以自已配制或订购。该步骤不允许加入 PVP-40 至BufferPAL 或自配的 CTAB 裂解液。
3. 有机物抽提：加入 700µl BufferBDP（或氯仿），涡旋混匀 15 秒。室温下，12,000×g 离心 5 分钟。富含多酚或淀粉的组织样品，可在第 3 步前，增加一步酚氯仿进行等体积抽提去除多糖和其它杂质。Buffer BDP 为氯仿代替物，主要成分为更低毒性的溴氯丙烷。皮肤接触时，立即脱去污染衣着，用大量流动清水冲洗，就医。
4. 调节结合条件（高盐介导）：转移 600µl上清液至新离心管中。加入 600µl BufferGWP，颠倒混匀 6-8 次。
（1）高盐介导：纯化柱 B10 在胍盐(GWP)条件下，只吸附 DNA 而不吸附 RNA，无需 RNA酶处理，但柱子最高吸附力只能达到 10µg，多余 DNA 会随滤液流出。高盐介导可有除去除色素、多糖和蛋白等代谢产物。
（2）醇类介导：若样品中 DNA 含量超过10µg 时，可改用乙醇介导来提高产量。转移600µl 上清液至新离 心管中, 加入 10µlRNaseA(自配)颠倒混匀，室温放置 10 分钟。加入 300µl Buffer GWP 和 600µl 无水乙醇，颠倒混匀 15-30 次，按第 5 步进行操作。
5. 过柱纯化：把纯化柱装在收集管中，转移一半体积混合液至柱子中。10,000×g 离心 1分钟。倒弃收集管中的滤液并装回柱子，把剩余混合液转移至柱子中再离心。
6. 去除蛋白和 RNA：倒弃滤液把柱子装回收集管，加入 400µl Buffer GWP，10,000×g离心 1 分钟。
7. 脱盐：倒弃滤液把柱子装回收集管，加入750µl BufferDW2，10,000×g 离心 1 分钟。DNA 浓度低于 50ng/µl，建议把 Buffer DW2分成两次，每次 500µl，可以稳定 A260/230比值。
8. 倒弃滤液把柱子装回收集管。10,000×g离心 1 分钟去除柱子中残留的乙醇。
9. 洗脱：将柱子转移至新的 1.5ml 离心管中，加入50µl预热到65℃ ElutionBuffer至柱子的膜中央。室温静置 3 分钟，10,000×g 离心1 分钟。
10. 再洗脱：再加入 50µl 预热至 65℃的ElutionBuffer 柱子的膜中央。放置 3 分钟。10,000×g 离心 1 分钟。
11. 丢弃 DNA 结合柱，把 DNA 保存于-20℃。
B. 难提取植物
处理低核酸含量或难提取样品，加入 PVP-40和β-巯基乙醇至 Buffer PAL 以提高裂解和抗氧化能力。按 1ml BufferPAL 加入 50µl40%PVP-40 和 20µl β-巯基乙醇，该混和液可以在室温保存一个月。
1. 样品研磨和裂解：用液氮把植物/真菌样品研磨成粉末，转移适量新鲜/冻藏样品或干燥样品至相应的离心管中，立即加入预热至65℃ Buffer PAL/PVP-40 混合液，涡旋使样品充分分散，65ºC 水浴 20 分钟，期间混匀2~3 次。BufferPAL 用量：按 100mg 新鲜或 20mg 干燥样品，加入 0.7ml BufferPAL。若样品中核酸含量低或需要获得更多 DNA，样品用量可以提升至200-500mg，按比例加入BufferPAL。更多的 BufferPAL 可以自已配制或订购。
2. 有机物抽提：加入等倍体积 BufferBDP 或氯仿，涡旋混匀 15 秒。室温下，10,000×g离心 5 分钟。提取富含多酚或淀粉样品，可在第 2 步前，增加一步酚氯仿进行等体积抽提去除杂质。Buffer BDP 为氯仿代替物，主要成分为更低毒性的溴氯丙烷。皮肤接触时，立即脱去污染的衣着，用大量的流动的清水冲洗，就医。更多的 Buffer BDP，可以另外订购。若总体积超过 2ml，用 5-15ml 离心管中进行操作，离心条件改为 4,000~5,000×g 离心 15 分钟。
3. 沉淀富集：转移上清液至新的离心管中，加入 0.7 倍体积异丙醇，温和地上下翻转混匀15~20 次。室温下，10,000×g 离心 5 分钟，小心倒弃所有上清液，保留沉淀。若总体积超过 2ml，用 5-15ml 离心管中进行操作，离心条件改为 4,000~5,000×g 离心 10分钟。当 DNA 比较丰富时，加入异丙醇混匀时，可以看到 DNA 形成的丝状或䋈状沉淀。由于多糖也会形成絮状沉淀，若这一步产生的沉淀很多，则表明样品富含多糖，第二次操作时，在第 2 步进行酚氯仿等体积抽提。若加入异丙醇混匀时，无明显的沉淀，可以于-20℃放置过夜后再离心收集 DNA，以提高 DNA 得率。
4. 溶解：短暂离心，吸尽所有残液。加入200µlElutionBuffer或灭菌水，65℃轻轻振荡温育10-15 分钟溶解 DNA。其它方法获得的粗制基因组 DNA 也可以用该方法进行纯化，用水将 DNA 补足至 250µl, 按第 6 步进行操作。
5. 过柱进一步纯化：加入 400µl BufferGWP至样品中，颠倒混匀数次。按实验步骤 A 第5-11 步进行操作。处理多糖类植物样品，DNA 样品可能存在明显凝块，于 50℃再温育 10 分钟，并移液器反复吸打让凝胶尽量分散，让 DNA 尽快从凝胶中释放出来。若 DNA 总量超过 10µg，再加入
0.2ml 异丙醇，颠倒混匀后按步骤 A 的第 5 步的过柱纯化操作。
OD 值测量和产量
1. A260/280 比值：本产品正常值 1.70~1.90。
2. A260/230 比值：本产品正常值为 1.1~2.4。若核酸浓度低于 50ng/µl 时，低于这个数据也是可以。
注意事项
本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
