本试剂盒用于检测样本中 DNase 的污染状况。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| DNase 检测试剂盒(荧光探针法) | HBP002902 | 192T |
| HBP002903 | 48T |
检验原理
DNase 检测试剂盒基于荧光基团标记的 DNA探针，当样本中不含 DNase 活性时，该探针稳定存在，不会产生荧光信号；当样本中含有DNase 活性时，探针被降解，产生逐渐增强的荧光信号；荧光信号增加的速率与酶的数量和活性成正相关。用荧光酶标仪在ex/em=485/525nm 波长下测定荧光信号增加倍数，判断样本是否被 DNase 污染。
主要组成成分
| 名称 | 192T | 48T |
|---|---|---|
| 10×反应液 | 2.0mL | 0.5mL |
| DNA探针 | 1管 | 1管 |
| TE缓冲液 | 2.0mL | 0.5mL |
| DNaseI 标准品(2U/μL) | 20μL | 10μL |
| 标准品稀释液 | 12mL | 6mL |
| 无 DNase无 RNase 水 | 25mL | 25mL |
| DNaseRNase清除剂 | 50mL | 50mL |
储存运输条件及有效期
1、-25~-15℃运输
2、试剂盒不同组分按如下温度分别储存：
| 名称 | 储存温度 |
|---|---|
| 10×反应液 | -25~-15℃ |
| DNA探针 | -25~-15℃ |
| TE缓冲液 | -25~-15℃ |
| DNaseI 标准品(2U/μL) | -25~-15℃ |
| 标准品稀释液 | -25~-15℃ |
| 无DNase无RNase 水 | -25~30℃ |
| DNaseRNase清除剂 | 2~30℃ |
3、未开封试剂盒储存 12 个月；
4、开封后试剂盒储存 6 个月，DNA 探针溶液建议根据单次使用量进行分装，避光储存，避免反复冻融。
所需设备与耗材
荧光酶标仪(含 ex/em=485/525nm 波长)无 DNase 无 RNase 移液器与吸头无 DNase 无 RNase EP 管无 DNase 无 RNase 黑色不透明底 96 孔板
实验前准备
1、将试剂盒取出平衡至室温（18~25℃）， 10×反应液、TE 缓冲液、DNaseI 标准品(2U/μL)、标准品稀释液等组分充分振荡混匀，然后瞬时离心（4000~7000rpm 离心 10 秒）。
2、将 DNA 探针 4000~7000rpm 离心 60 秒，使之聚集至管底，小心开启管盖，加入 40μL TE 缓冲液溶解为探针储存液，根据单次使用量进行分装后于-25~-15℃储存，避免反复冻融。每次使用时取出探针储存液，稀释 50 倍（如 10μLDNA 探针加入 490μL TE 缓冲液），作为 DNA 探针工作溶液，未使用完的 DNA 探针工作溶液于-25~-15℃储存，避光储存，避免反复冻融。
检验步骤
1、首次测试前需调节合适的增益值，以避免灵敏度下降或信号过饱和的风险：
1）设置仪器参数：温度 37℃终点模式检测前振板 10~15s激发波长λEx= 485 nm发射波长λEm = 525 nm若仪器有自动增益选项，则选用自动增益，若没有自动增益选项，则根据增益值范围设置中间值。
注：不同仪器设置方法不一致，具体咨询仪器供应商。
2）在96孔板上选择2孔，每孔加入10μL DNA探针工作溶液和 10μL 10×反应液；
3）其中 1 孔加入 80μL 无 DNase 无 RNase水，另外 1 孔加入 79μL 无 DNase 无 RNase水+1μLDNase I 标准品(2U/μL)；
4）37℃避光放置，30min 后测试；
5） 选用自动增益时，在数据文件中的仪器参数栏会显示增益值（Gain），记为 G1；
6）根据增益值范围设置中间值时，需注意：若加标准品孔的荧光值超过仪器上限，则适当降低增益值，若加标准品孔的荧光值远低于仪器上限，则适当提高增益值；最终得到合适的增益值，记为 G2。
2、测试仪器参数温度 37℃；检测前振板 10~15s激发波长λEx= 485 nm发射波长λEm = 525 nm；增益值设定为检测步骤 1 中自动增益得到的 G1 或调节过的增益值 G2；若酶标仪支持动力学检测，推荐采用动力学检测模式，1~1.5min 间隔，总时间 30min。
3、样品准备推荐的样本体积为 80μL，若待测样本不足 80 μL，用无 DNase 无 RNase 水稀释至 80μL。若待测样本中含有影响荧光基团发光的物质（如深色溶液，高浓度的黏性物质或表面活性剂），应使用无 DNase 无 RNase 水稀释样本，但请注意稀释操作会影响灵敏度；若待测样本中含 DNA 酶活性抑制剂（如高离子强度溶液、pH<4 或 pH>9 的缓冲液、蛋白变性剂等），则测定结果为样本溶液的整体酶活性，而不是样本溶液中酶的单独活性。 DNase I 标准品(2U/μL)，用标准品稀释液按下表稀释：
| 编号 | 配制过程 | 浓度 |
|---|---|---|
| 1 | 2μL 标准品原液+198μL标准品稀释液 | 2×10 -2 U/μL |
| 2 | 2μL 编号1样本+198μL标准品稀释液 | 2×10 -4 U/μL |
再将编号 2 样本用无 DNase 无 RNase 水稀释 10 倍：
| 编号 | 配制过程 | 浓度 |
|---|---|---|
| 3 | 20μL 编号2样本+180μL无DNase无RNase 水 | 2×10 -5 U/μL |
编号3样本作为阳性对照；无DNase无RNase水作为阴性对照。
4、加样及检测
1）96 孔板每孔加入 10μLDNA 探针工作溶液和 10μL 10×反应液；
2）选取其中 4 孔分别加入阴性对照，阳性对照，其余孔加入待测样本，每种样本 2 个复孔，每孔 80μL；
3）立即测试读取0min荧光信号值RFU0，37℃避光放置 30min 后，再次测试读取 30min 荧光信号值 RFU30，若采用动力学模式，则可读取 0~30min 所有荧光信号。
检测结果的解释
若 RFU30 (待测样本)≥2×RFU0 （待测样本），则考虑待测样本被 DNase 污染。
注：若待测样本严重污染或含有干扰物质时，可能会出现 RFU0 (待测样本)＞RFU0 (阳性质控)，且RFU30 (待测样本)＜2×RFU0 (待测样本)，导致假阴性判断，此时应将待测样本用无DNase 无 RNase 水进行预稀释，再进行检测。
定量检测
当待测样本有污染，需判断样本中 DNase 的浓度值时，可通过以下程序测定：将 DNase I 标准品(2U/μL)，用标准品稀释液按下表稀释：
| 编号 | 配制过程 | 浓度 |
|---|---|---|
| 1 | 2μL 标准品原液+198μ L标准品稀释液 | 2×10 -2 U/μL |
| 2 | 2μL 编号1样本+198μ L标准品稀释液 | 2×10 -4 U/μL |
| 3 | 100μL 编号2样本+100 μL标准品稀释液 | 1×10 -4 U/μL |
| 4 | 100μL 编号3样本+100 μL标准品稀释液 | 5×10 -5 U/μL |
| 5 | 100μL 编号4样本+100 μL标准品稀释液 | 2.5×10 -5 U/μL |
| 6 | 100μL 编号5样本+100 μL标准品稀释液 | 1.25×10 -5 U/μL |
再将编号 3~6 样本用无 DNase 无 RNase 水稀释 10 倍：
| 编号 | 配制过程 | 浓度 |
|---|---|---|
| 7 | 20μL 编号3样本+180μL无DNase无RNase 水 | 1×10 -5 U/μL |
| 8 | 20μL 编号4样本+180μL无DNase无RNase 水 | 5×10 -6 U/μL |
| 9 | 20μL 编号5样本+180μL无DNase无RNase 水 | 2.5×10 -6 U/μL |
| 10 | 20μL 编号6样本+180μL无DNase无RNase 水 | 1.25×10 -6 U/μL |
编号 7~10 样本作为标准品；无 DNase 无RNase 水作为 0 浓度样本。将 0 浓度样本、标准品及有污染的待测样本，按检测步骤一同测试，得到 RFU0、RFU30；计算∆RFU=RFU30 -RFU0，以∆RFU(0 浓度)、 ∆RFU(标准品)为纵坐标，标准品 DNase I 浓度为横坐标(0 浓度为 0)，进行线性拟合，求出拟合方程 y=ax+b，相关性系数 r 要≥0.99，将∆RFU(污染样本)作为 y 带入方程，求出 x，乘以样本预稀释倍数后，为污染样本的大致浓度值。
注：因仪器信号波动，可能会出现∆RFU＜0的情况，此时按∆RFU=0 计算。
检测性能
1、检出限：DNase I：1.25x10 -6 U/μL
2、精密度：批内变异系数≤10%，批间变异系数≤15%
注意事项
1、加样操作应尽量快，时间过长会影响实验准确性。
2、不同荧光酶标仪的参数不一样，首次测试前需调节合适的增益值。
3、所有试剂使用前应充分摇匀，加样时应将所加样物加入酶标板孔中底部，避免加在孔壁上部，加样时注意不可溅出，不可产生气泡。
4、试剂盒中标准品为 DNase I，其活性单位定义为：在 DNase I 反应缓冲液中，37℃条件下 10 分钟内能够完全降解 1µgpBR322 DNA所需的酶量 [1]，一个 DNase I 活性单位相当于
0.3 Kunitz 单位 [2]。
5、为避免外源 DNase 污染，可使用 DNase RNase 清除剂喷洒于实验台面、手套等表面， 5 分钟后用洁净纸巾擦拭干净即可进行后续的实验操作。
参考文献
[1]New England BiolabsDNase I 产品手册
[2] Kunitz M . Crystalline Desoxyribo -nuclease I. Isolation and General Pro -perties Spectrophotometric Method for the Measurement of Desoxyribonuclease Activity[J]. The Journal of General Physiology,1950, 33(4):349-362.
