DpnI 是经过基因工程重组的快速限制性内切酶，适用于质粒 DNA、PCR 产物或基因组 DNA 等的快速酶切。所有快速内切酶在通用的 CutFlex 或 CutFlex Color Buffer 中都具有优良的活性，能够在 5~15 分钟内完成酶切。CutFlex Color Buffer 包括红色和黄色示踪染料，可将产物直接用于凝胶电泳。CutFlex Color Buffer 的红色染料与 2500 bp 双链 DNA 片段在 1%琼脂糖凝胶中迁移速率接近；黄色染料与 10 bp 双链 DNA 片段在 1%琼脂糖凝胶中迁移速率接近。
DpnI 可识别特异性位点，其识别序列和切割位点如下：
同裂酶：MalI
注：同裂酶对于不同的甲基化修饰可能具有不同敏感性。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 包装规格 |
|---|---|---|
| DpnI | HSM050231 | 50 rxn |
产品组分
| 组分 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| DpnI（1 rxn/μL） | HSM050231A | 50 rxn |
| 10× CutFlex Buffer | HSM051001 | 1 mL |
| 10× CutFlex Color Buffer | HSM051011 | 1 mL |
运输及保存方法
-25~-15℃运输与保存。
建议反应条件
1× CutFlex 缓冲液；
37℃温育；
参照“DNA 快速酶切流程”配制反应体系。
失活条件
80℃温育 20 min。
质量控制
功能活性检测：37℃下，在 20 μL 通用 CutFlex 反应体系中，1 μL DpnI 能够在 15 min 内完全消化 1 μg pUC19 DNA。
超长时间温育检测：37℃下，在 20 μL 通用 CutFlex 反应体系中将 1 μL DpnI 与 1 μg pUC19 DNA 共同温育 3 h，未检测到其他核酸酶污染或星号活性引起的底物非特异性降解。更长时间酶切可能出现星号活性。
非特异性内切酶活性检测：37℃下，在 20 μL 通用 CutFlex 反应体系中将 1 μL DpnI 与 1 μg 超螺旋质粒 DNA 共同温育 4 h 后，使用琼脂糖凝胶电泳检测，少于 10%的质粒 DNA 转变成缺刻或线性状态。
产品应用
限制性内切酶消化、快速克隆。
反应体系和条件
1. DNA 快速酶切流程
在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系：
| 组分 | 质粒 DNA | 基因组 DNA |
|---|---|---|
| ddH2O | 15 μL | 30 μL |
| 10× CutFlex Buffera | 2 μL | 5 μL |
| 底物 DNA | 2 μL（up to 1 μg） | 10 μL（5 μg） |
| DpnI | 1 μL | 5 μL |
| Total | 20 μL | 50 μL |
轻柔吸打或轻弹管壁以混匀（切勿涡旋），然后瞬时离心以收集挂壁液滴。
反应条件：37℃温育 15 min（质粒），或 30~60 min（基因组 DNA）。
热失活（可选）：80℃温育 20 min 即可使酶失活，停止反应。
a：可替换为 10× CutFlex Color Buffer 进行酶切反应，得到的产物可以直接进行上样电泳。
2. 双酶切或多酶切
• 每种快速内切酶的用量为 1 μL，并根据需要适当扩大反应体系。
• 所有快速内切酶的体积总和不得超过总反应体系的 1/10。
• 如果所用的几种快速内切酶的最适反应温度不同，应先以最适温度低的酶开始酶切，再添加最适温度较高的酶，在其最适反应温度下进行酶切反应。
3. 适用于质粒的扩大反应体系
| 组分 | 加入量 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| DNA | 1 μg | 2 μg | 3 μg | 4 μg | 5 μg |
| DpnI | 1 μL | 2 μL | 3 μL | 4 μL | 5 μL |
| 10× CutFlex Buffera | 2 μL | 2 μL | 3 μL | 4 μL | 5 μL |
| Total | 20 μL | 20 μL | 30 μL | 40 μL | 50 μL |
a：可替换为 10× CutFlex Color Buffer 进行酶切反应，得到的产物可以直接进行上样电泳。
注：如果总反应体系大于 20 μL，应适当增加温育时间，尽量使用水浴、金属浴或沙浴。
4. 适用于 PCR 产物中消化质粒模板
将 1 μL DpnI 加入 50 μL PCR 产物中混匀，37℃温育 60 min，80℃温育 20 min 热失活，得到的产物可用于下游转化实验。
甲基化修饰影响
Dam 甲基化：无影响
Dcm 甲基化：无影响
CpG 甲基化：剪切受影响
EcoKI 甲基化：无影响
EcoBI 甲基化：剪切受影响
不同 DNA 中的酶切位点数量
| DNA | 酶切位点数量 |
|---|---|
| λDNA | 116 |
| ΦX174 | 0 |
| pBR322 | 22 |
| pUC57 | 15 |
| pUC18/19 | 15 |
| SV40 | 8 |
| M13mp18/19 | 7 |
| Adeno2 | 87 |
在不同反应缓冲液中的活性
| Buffer | 活性 |
|---|---|
| CutFlex Buffer | 100% |
| Thermo Scientific FastDigest Buffer | 100% |
| NEB rCutSmart™ Buffer | 100% |
| Takara QuickCut™ Buffer | 100% |
注：活性数据来自瀚海新酶限制酶标准反应体系下的检测。
DNA 修饰酶在 Buffer 中的活性
| DNA 修饰酶 | Buffer | 活性 |
|---|---|---|
| T4 DNA 连接酶（HSM060201） | 10× CutFlex Buffer | 100% |
| 10× CutFlex Color Buffer | 100% |
注：活性数据来自瀚海新酶标准反应体系下的检测；T4 DNA Ligase 需要 ATP 作为辅助因子。
