本试剂盒利用 TaqMan 荧光探针的 qPCR 检测原理对重组蛋白、抗体、疫苗等生物制品中 E.coli 细胞残留 DNA 进行定量测定，检测快速，专一性强。仅供研究使用，不可用于临床。本检测方法可溯源至中国药典方法，通则<3407>。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| E.coli 细胞残留 DNA 检测试剂盒 | HBP003503 | 100 reactions |
试剂盒组成
| 名称 | 规格 | 支数 | 储存条件 |
|---|---|---|---|
| E.coli DNA Positive Control | 30ng/μL 50μL | 1 | -25℃~-15℃ |
| Compound of primers and probes | 0.5mL | 1 | -25℃~-15℃，避光 |
| qPCR Master Mix | 1.5mL | 1 | -25℃~-15℃，避光 |
| DNA Dilution Buffer | 1.5mL | 3 | -25℃~-15℃ |
储存条件及有效期
1. 有效期：规定储存条件下 24 个月。
2. 运输和储存：长时间储存请放置在-25~-15℃，运输过程中请放置在干冰或冰袋中。
E.coli DNA 阳性对照标准曲线样品的制备
E.coli DNA 阳性对照品浓度标注于管壁标签上，确认实际浓度后再进行稀释。用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将 E.coli DNA 阳性对照品进行梯度稀释，稀释浓度依次为 3000pg/μL、300pg/μL、30pg/μL、3pg/μL、0.3pg/μL、0.03pg/μL。
具体操作如下：
1. 将试剂盒中的 E.coli DNA 阳性对照品和 DNA 稀释液从-20℃取出后置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，快速离心 2~5 秒。
2. 取 7 支低吸附离心管，分别标记为 ST0、ST1、ST2、ST3、ST4 和 ST5。按下表准备 E.coli DNA 标准样品，每步稀释后各管均用旋涡混合器混匀，快速离心 2~5 秒，再进行下一个梯度稀释，标准样品稀释完后 2~8℃保存，现配现用。
E.coli DNA 阳性对照品的稀释
| 稀释管 | 稀释步骤 | 浓度（pg/μL） |
|---|---|---|
| ST0 | 10μL DNA 阳性对照品 + 90μL DNA 稀释液 | 3000 |
| ST1 | 10μL ST0 + 90μL DNA 稀释液 | 300 |
| ST2 | 10μL ST1 + 90μL DNA 稀释液 | 30 |
| ST3 | 10μL ST2 + 90μL DNA 稀释液 | 3 |
| ST4 | 10μL ST3 + 90μL DNA 稀释液 | 0.3 |
| ST5 | 10μL ST4 + 90μL DNA 稀释液 | 0.03 |
已融化未使用的 DNA 稀释液可暂存于 2-8℃
加样回收质控 ERC 的制备
根据需要设置 ERC 中的 E.coli DNA 加标量（建议加标量设定为其样品历史无加标测试值的 2~30 倍），以制备加 30pg E.coli DNA 量的供试品 ERC 为例，具体操作如下：
1. 取 100μL 供试品加入 1.5mL 低吸附离心管中。
2. 加入 10μL ST3，混匀，标记为供试品 ERC。
3. 样本 ERC 与同批供试品一起进行前处理，制备成供试品 ERC 纯化液。
阴性质控 NCS 的制备
根据实验设置阴性质控，具体操作如下：
1. 取 100μL 供试品基质溶液（或 DNA 稀释液）加入 1.5mL 低吸附离心管中标记为阴性质控 NCS。
阴性质控 NCS 和同批供试品一起进行前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化液。
qPCR 反应体系
1. 根据所要检测的标准曲线及待测样本数量，计算所需反应孔数。
反应孔数=（5 个浓度梯度的标准曲线样品+1 个空白对照 BLK+1 个阴性质控 NCS+供试品+供试品 ERC）×3；
2. 根据反应孔数计算本次所需的反应混合液的总量：
反应混合液总量=（反应孔数+2）×（15μL qPCR Master Mix + 5μL Compound of primers and probes）（含有 2 孔的加样误差损失量）
3. 各试剂置于室温融化后，根据上一步所计算的引物与 Mix 的量配置所需要的反应混合液，轻微振荡混匀，然后按下表所示加样：
| 样品 | 加样 |
|---|---|
| 标准曲线 | 20μL 反应混合液 + 10μL ST1/ST2/ST3/ST4/ST5 |
| BLK | 20μL 反应混合液 + 10μL DNA 稀释液 |
| NCS | 20μL 反应混合液 + 10μL NCS 纯化液 |
| 供试品 SAM | 20μL 反应混合液 + 10μL DNA 待测样本纯化液 |
| 供试品 ERC | 20μL 反应混合液 + 10μL 样本 ERC 纯化液 |
qPCR 反应的加样
1. 取 96 孔 PCR 板，在所需各孔内先加入 20μL 反应混合液。
2. 按照表 4 加样表，分别加入 BLK，NCS，SAM，ERC，并依次从低到高加入 10μL ST1、ST2、ST3、ST4 和 ST5 DNA 标准品溶液，所有加样均为 3 复孔。
3. 粘性膜封板涡旋 30S 混匀，离心待 qPCR。
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| A | BLK | BLK | BLK | |||||||||
| B | NCS | NCS | NCS | ST5 | ST5 | ST5 | ||||||
| C | SAM1 | SAM1 | SAM1 | ST4 | ST4 | ST4 | ||||||
| D | SAM2 | SAM2 | SAM2 | ST3 | ST3 | ST3 | ||||||
| E | SAM3 | SAM3 | SAM3 | ST2 | ST2 | ST2 | ||||||
| F | ERC1 | ERC1 | ERC1 | ST1 | ST1 | ST1 | ||||||
| G | ERC2 | ERC2 | ERC2 | |||||||||
| H | ERC3 | ERC3 | ERC3 |
qPCR 仪运行程序设置
以 Applied Biosystems® 7500 Fast qPCR 仪为例。
1. 创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。
2. 创建新检测探针，命名为 E.coli-DNA，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 TAMRA，检测参比荧光为 ROX。
3. 设置两步法反应程序：
4. 95℃预变性 10 min；95℃ 15s，60℃ 1min，40 个循环；反应体积 30μL。
标准曲线 PCR 结果
结果计算
1. 供试品结果计算
按下式计算供试品的 DNA 残留量：
复孔变异系数的计算：
如 DNA 抽提样品检测结果在检测下限（ST5）附近（Ct 值±2 个循环）或检测结果 Ct 大于 ST5，不计算变异系数。
2. 加标供试品回收率的计算
加标样品经过与样品同法处理后，根据 PCR 的标准曲线方程以及加标样品的 Ct 值，计算加标样品的 DNA 含量，根据加标的标示量，计算加标回收率。
注意事项
• 使用化学药品时，一定要穿戴合适的实验服、一次性手套和护目镜。
• 如试剂一次用不完，请放-20℃冰箱保存。
• 如在操作过程中，不慎将试剂溅入眼口鼻，请立即用大量的清水冲洗。
• 如果发现标签、试管壁出现污损、字迹不清楚等情况请停止使用该试剂盒。
