EcoRI 是经过基因工程重组的快速限制性内切酶，适用于质粒 DNA、PCR 产物或基因组 DNA 等的快速酶切。所有快速内切酶在通用的 CutFlex 或 CutFlex Color Buffer 中都具有优良的活性，能够在 5~15 分钟内完成酶切。 CutFlex Color Buffer 包括红色和黄色示踪染料，可将产物直接用于凝胶电泳。CutFlex Color Buffer 的红色染料与 2500 bp 双链 DNA 片段在 1%琼脂糖凝胶中迁移速率接近； 黄色染料与 10 bp 双链 DNA 片段在 1%琼脂糖凝胶中迁移速率接近。 EcoRI 可识别特异性位点，其识别序列和切割位点如下：
同裂酶：FunII
注：同裂酶对于不同的甲基化修饰可能具有不同敏感性。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 包装规格 |
|---|---|---|
| EcoRI | HSM050291 | 600 rxn |
产品组分
| 组分 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| EcoRI（1 rxn/μL） | HSM050291A | 600 μL |
| 10×CutFlex Buffer | HSM051001 | 2×1 mL |
| 10×CutFlex Color Buffer | HSM051011 | 2×1 mL |
运输及保存方法
-25~-15℃运输与保存。
建议反应条件
1× CutFlex 缓冲液； 37℃温育； 参照“DNA 快速酶切流程”配制反应体系。
失活条件
80℃温育 20 min。
质量控制
功能活性检测：37℃下，在 20 μL 通用 CutFlex 反应体系中，1 μL EcoRI 能够在 15 min 内完全消化 1 μg λDNA。
超长时间温育检测：37℃下，在 20 μL 通用 CutFlex 反应体系中将 1 μL EcoRI 与 1 μg λDNA 共同温育 3 h，未检测到其他核酸酶污染或星号活性引起的底物非特异性降解。更长时间酶切可能出现星号活性。
酶切-连接-再酶切检测：37℃下，使用 10 倍酶量的 EcoRI 消化 DNA 底物，回收酶切产物， 在 22℃下使用 T4 DNA Ligase 可以将超过 95%的酶切产物重新连接。将连接产物再次回收后，使用相同的内切酶可以重新切开 95% 以上的连接产物。
非特异性内切酶活性检测：37℃下，在 20 μL通用CutFlex反应体系中将1 μL EcoRI 与 1 μg 超螺旋质粒 DNA 共同温育 4 h 后，使用琼脂糖凝胶电泳检测，少于 10%的质粒 DNA 转变成缺刻或线性状态。
蓝白斑检测：使用1 μL EcoRI 消化含有lacZ α 基因且仅在该基因上具有 1 个酶切位点的特定载体。将酶切产物重新连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，涂布在含有 X-gal、IPTG 和相应抗生素的 LB 平板培养基上生长。成功连接的β-半乳糖苷酶基因可以正确表达，并生长出蓝色菌落；而因酶切末端降解等原因未能重新连接的产物将得到白色菌落。白色菌落的比例应当小于 1%。
产品应用
限制性内切酶消化、快速克隆。
反应体系和条件
1. DNA 快速酶切流程
(1) 在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系
| 组分 | 质粒 DNA | PCR 产物 | 基因组 DNA |
|---|---|---|---|
| ddH2O | 15 μL | 16 μL | 30 μL |
| 10× CutFlex Buffera | 2 μL | 3 μL | 5 μL |
| 底物 DNA | 2 μL (up to 1 μg) | 10 μL (~0.2 μg) | 10 μL (5 μg) |
| EcoRI | 1 μL | 1 μL | 5 μL |
| Total | 20 μL | 30 μL | 50 μL |
(2) 轻柔吸打或轻弹管壁以混匀（切勿涡旋），然后瞬时离心以收集挂壁液滴。
(3) 反应条件：37℃温育 15 min（质粒），或 15~ 30 min（PCR 产物），或 30~60 min（基因组 DNA）。
(4) 热失活（可选）：80℃温育 20 min 即可使酶失活，停止反应。 a:可替换为10× CutFlex Color Buffer进行酶切反应，得到的产物可以直接进行上样电泳。
注：PCR 产物酶切体系适用于经过纯化的PCR 产物酶切。未纯化的 PCR 产物具备一定的离子强度，10× CutFlex Buffer 加入量可适当减少至 2 μL。但由于 DNA 聚合酶同时具有外切酶活性，会影响酶切产物，因此如下一步需进行克隆等操作，建议酶切前对 PCR 产物进行纯化。
2. 双酶切或多酶切
• 每种快速内切酶的用量为 1 μL，并根据需要适当扩大反应体系。
• 所有快速内切酶的体积总和不得超过总反应体系的 1/10。
• 如果所用的几种快速内切酶的最适反应温度不同，应先以最适温度低的酶开始酶切，再添加最适温度较高的酶，在其最适反应温度下进行酶切反应。
3. 适用于质粒的扩大反应体系
| 组分 | 加入量 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| DNA | 1 μg | 2 μg | 3 μg | 4 μg | 5 μg |
| EcoRI | 1 μL | 2 μL | 3 μL | 4 μL | 5 μL |
| 10× CutFlex Buffera | 2 μL | 2 μL | 3 μL | 4 μL | 5 μL |
| Total | 20 μL | 20 μL | 30 μL | 40 μL | 50 μL |
a:可替换为 10× CutFlex Color Buffer 进行酶切反应，得到的产物可以直接进行上样电泳。
注：如果总反应体系大于 20 μL，应适当增加温育时间，尽量使用水浴、金属浴或沙浴。
甲基化修饰影响
Dam 甲基化：无影响
Dcm 甲基化：无影响
CpG 甲基化：剪切受影响
EcoKI 甲基化：无影响
EcoBI 甲基化：剪切受影响
不同 DNA 中的酶切位点数量
| DNA | 酶切位点数量 |
|---|---|
| λDNA | 5 |
| ΦX174 | 0 |
| pBR322 | 1 |
| pUC57 | 1 |
| pUC18/19 | 1 |
| SV40 | 1 |
| M13mp18/19 | 1 |
| Adeno2 | 5 |
在不同反应缓冲液中的活性
| Buffer | 活性 |
|---|---|
| CutFlex Buffer | 100% |
| Thermo Scientific FastDigest Buffer | 100% |
| NEB rCutSmart™ Buffer | 100% |
| Takara QuickCut™ Buffer | 100% |
注：活性数据来自瀚海新酶限制酶标准反应体系下的检测。
DNA 修饰酶在 Buffer 中的活性
| DNA 修饰酶 | Buffer | 活性 |
|---|---|---|
| T4 DNA 连接酶（HSM060201） | 10× CutFlex Buffer | 100% |
| 10× CutFlex Color Buffer | 100% |
注：活性数据来自瀚海新酶标准反应体系下的检测；T4 DNA Ligase 需要 ATP 作为辅助因子。
