本产品适合于从 100~300ml 细菌培养液中提取 100~1500µg 低内毒素的质粒 DNA。产品采用独特的溶液体系，可处理各种质粒载体，包括常规高低中拷贝数的载体、大型载体，如 BAC，Cosmid，P1 等。DNA 产量取决于载体拷贝数和菌液量。快速纯化步骤质粒可直接用于细胞转染。质粒按附加流程进一步纯化后，可用于高敏细胞转染和动物注射。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| 无内毒素质粒大提试剂盒 | HSM010061-01 | 2T |
| HSM010061-02 | 10T |
产品组分
| 组分 | HSM010061-01 | HSM010061-02 | 主要组分 | 组分功能 |
| 包装次数 | 2T | 10T | / | / |
| RNase A | 100µL | 10mg | 核糖核酸酶A | 降解RNA |
| Buffer P1 | 20ml | 100ml | Tris/EDTA | 菌体重悬 |
| Buffer P2 | 20ml | 100ml | NaOH/SDS | 碱裂解 |
| Buffer LN3 | 10ml | 50ml | 醋酸钾/醋酸 | 中和液 |
| Buffer ER2 | 6ml | 30ml | 曲拉通 X-114 | 萃取除内毒素 |
| Buffer GWP | 11ml | 60ml | 胍盐 | 洗涤除RNA |
| Buffer EWB | 11ml | 60ml | 异丙醇/去毒剂 | 洗涤除内毒素 |
| Buffer PW2 | 6ml | 20ml | 乙醇/Tris/NaCl | 洗涤除盐离子 |
| Elution Buffer (Endo Free) | 10ml | 20ml | 10mM Tris, pH8.5 | 洗脱液 |
| Buffer CL | 6ml | 30ml | NaOH | 激活结合力 |
| Clear Midi Syringe | 2 | 10 | 过滤器 | 过滤杂质 |
| 纯化大柱 B30 | 2 | 10 | 玻璃纤维滤膜 | 吸附核酸 |
| 50ml Collection Tube C | 2 | 10 | 收集管 | 收集滤液 |
准备事项
1. 加入 0.5mlBufferP1 至 RNaseA 干粉，吸打溶解，然后全部转移至 Buffer P1 中。若RNaseA是液体的，短暂离心后转移至BufferP1 中，于 2-8℃保存，有效期为 6 个月。
2. 按瓶子标签所示，加入 4 倍体积的无水乙醇稀释 BufferPW2，于室温保存。
实验流程（转染级）
1. 初级培养：将含目的质粒的大肠杆菌菌种接种于含 1ml LB/抗生素培养基的 5-10ml培养管中，37℃摇床培养 6~8 小时进行小量扩增菌液。培养方法：在无菌条件下，用灭菌牙签挑取一单菌落，转移 1ml 含相应抗生素的 LB 培养基中，37℃摇床(200-300rpm)培养 6-8 小时。甘油保存菌种在保存过程可能会丢失载体，先划平板进行活化，用灭菌牙签挑取一单菌落进行初步培养。
2. 扩 大 培 养： 在 0.5~2L 培 养 瓶 中 加 入100~300mL 含抗生素 LB 培养液，移液器
0.1~0.3ml 初级菌液至培养瓶中，37℃摇床培养 12~16 小时。培养瓶容量最好超过培养液体积的 4-5 倍,培养良好的菌液(LB 培养液)，OD600 应该在
2.0-3.0。2 x YT 或 TB 培养液中菌体生长速度过快，不利于质粒充分复制，应尽量避免使用。使用 YT 或 TB 培养液时，按细菌生物量进行转换。高拷贝生物量为 450，低拷贝生物量 900. 若 YT/TB 培养液培养后，OD600=10，则高拷贝菌液量为 45ml，低拷贝菌液用量90ml。
3. 菌体收集：转移 100~150ml（高拷贝）或200~300ml（低拷贝）培养液到适合的离心管中，8,000rpm 离心 5 分钟。纯化大柱 B30 最大结合力为 1500µg, 高拷贝载体只需要用 100ml 菌液，超量 DNA 因无法吸附而随滤液流出。处理低拷贝载体，菌液用量可以达到 300ml。
4. 菌体重悬：倒弃培养基，在吸水纸上轻轻拍打以吸尽残液，加入 6ml 或 9.0ml BufferP1/RNaseA 混和液至菌体中, 高速涡旋重悬细菌。充分重悬细菌对产量很关键，重悬后应看不到明显的菌块。若涡旋未能充分打散菌块，用移液器吸打数次。为减少样品的过柱次数（第 12步），本产品采用高密度裂解，减少碱裂解试剂用量，在裂解和中和时，需要增加混合次数以达到充分裂解和中和效果。用户可以按常规习惯，按 1.5 倍增加 Buffer P1/P2/LN3 用量进行中密度裂解中和，提高碱裂解效率。
5. 菌体裂解：加入 6ml 或 9.0mlBufferP2，温和地上下颠倒并转动离心管 15~20 次。室温静置 5 分钟，其间颠每隔 1 分钟温和地颠倒混匀 6-8 次。颠倒混匀不要涡旋。充分裂解后，整个溶液变成均一的溶液而且透亮。涡旋会造成基因组污染。混匀后溶液应变得粘稠而透亮。若溶液未能变得清亮，可能菌体过多而裂解不彻底，下次实验减少菌体用量或增加 BufferP1,BufferP2 和 BufferLN3 用量。当菌液用量达 150ml/300ml 时，裂解液会极为粘稠，属于高密度碱裂解类型，混匀时需要更多次数的颠倒和翻转动作，并轻稍振荡让菌体充分裂解，形成均一无团块的裂解液。
6. 菌体中和：加入 3ml 或 4.5mlBufferLN3至裂解液，稍快速上下颠倒混匀 20~30 次或直至形成蛋白状悬浊液。加入 Buffer LN3 后应立即稍快速上下颠倒混匀，以避免产生局部沉淀。当菌液用量达150ml/300ml 时，属于高密度碱裂解类型，中和时会形成大块且紧密的沉淀团，混匀时需要更多次数的颠倒和翻转动作，并轻稍振荡让大块沉块团分散成较少的团块，让 BufferLN3 完全渗透到沉淀内部进行充分中和。
7. 离心除杂质：8,000rpm 离心 5 分钟。
8. 过滤除杂质：取出过滤器活塞，倒入上清液至针筒，插入活塞挤出液体至离心管中。
9. 调整结合条件：测量滤液体积，加入 0.1倍体积 BufferER2，颠倒混匀 8~10 次，加入 0.5 倍体积无水乙醇，颠倒混匀 8~10 次。无水乙醇体积=0.5 x (滤液体积+Buffer ER2的体积)。
10. 平衡柱子: 将纯化大柱 B30 套在收集管中，转移 2.5mlBufferCL 至柱子，静置 2~3分钟，8,000rpm 离心 1 分钟。BufferCL 中含有 NaOH，可以激活柱子的吸附力。为减少离心操作，步骤 10-14 可以用负压抽滤进行过柱操作，进行负压操作时，请另外订购抽滤配件（VC2-10）。
11. 过柱纯化：倒弃滤液把柱子套回收集管，转移 10~13ml 混合液(第 9 步)至柱子中，8,000rpm 离心 1 分钟，重复这一步直至混合液都转移至柱子并离心。纯化柱的最大容积为 13 ml，需要分 3 次过柱。若离心机转子倾角较大，建议加入不超过13 ml，以防产生漏液现象。受离心机角度影响，以及大量试剂反复过柱，柱子中表层滤膜会有少量脱落，这属于正常现象，不影响提取效果。
12. 洗掉 RNA：倒弃滤液把柱子套回收集管，加入 5ml Buffer GWP，静置 3 分钟，8,000rpm 离心 1 分钟。
13. 洗内毒素：倒弃滤液把柱子套回收集管，加入 5mlBufferEWB，8,000rpm 离心 1 分钟。
14. 脱盐：倒弃滤液把柱子套回收集管，加入9mlBufferPW2，8,000rpm 离心 10 分钟。
15. 干燥：取出纯化大柱 B30，打开盖子室温放置 10~15 分钟晾干滤膜，倒弃收集管的滤液，并在吸水纸拍打吸尽残液，晾干收集管。滤液（BufferSW2)含 80%乙醇可以起用浸泡灭菌作用，倒弃滤液干燥后，50ml 离心管中可以用于第 16 步的质粒 DNA 收集。
16. 洗 脱：把柱子套回 50ml 收集管，加入
0.8mlElutionBuffer 至柱子膜中央，静置 3分钟，8,000rpm 离心 3 分钟。这一步可洗脱出 60-75% DNA，若需最高浓度，省略第 17 步的二次洗脱或两次洗脱分开。
17. 再加入 0.8ml Elution Buffer 至柱子膜中央，静置 3 分钟，8,000rpm 离心 3 分钟。丢弃柱子，转移质粒至新的 2ml 离心管中，转移至-20℃保存。
• 为了增加质粒的回收效率，建议将得到的质粒溶液重新加入吸附柱中，进行第二次洗脱。 由于滤膜存在吸水性，会有~0.15ml 洗脱液损失。洗脱体积不建议低于 0.7ml。
• 这一步得到的质粒 DNA 可以直接用于细胞转染，但不建议用于动物注射或敏感细胞转染。附加流程用 Buffer ER2 (Triton X-114)抽提进一步降低内毒素水平后，可以用于动物注射和高敏细胞转染。
附加流程(进一步纯化质粒 DNA，注射级)
1. 取质粒 DNA 至 2.0ml 离心管中，加入适量的灭菌水或 Elution Buffer 至总体积为
1.5ml。
2. 加入 150ul Buffer LN3 和 150ul BufferER2, 颠倒数次，冰上（或 2-8 ℃冰箱）放置10~15 分钟，45-55℃温育 5 分钟沉淀内毒素形成浑浊液。
3. 室温下，13,000xg 离心 5 分钟，转移上清液至新的离心管中。离心后管底分层成红色液层，若没有形成分层，颠倒数次，45-50℃温育 5 分钟再重复离心，并确保离心机已完全恢复至室温。
4. 加入 0.7 倍上清液体积的异丙醇，混匀，静置 10 分钟，13,000x g 离心 15 分钟。为更方便操作，可以把混合液转移至数个
1.5-2.0ml 离心管中进行操作。
5. 小心倒弃上清液，加入 1.0ml 的 75%乙醇，涡旋 5 秒，13,000xg 离心 5 分钟。
6. 小心倒弃上清液。短暂离心吸尽所有残液，空气干燥 5~10 分钟。
7. 加入适量灭菌水至沉淀中，涡旋混匀，室温放置 5-10 分钟让质粒充分溶解。
注意事项
本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
