本产品适合于从 50~75mL 细菌培养液中提取高达 300µg 低内毒素的质粒 DNA。产品采用独特的溶液体系，可处理各种质粒载体，包括常规高低中拷贝数的载体、大型载体，如 BAC，Cosmid，P1 等。DNA 产量取决于载体拷贝数和菌液量。纯化的质粒内毒素含量低于 0.1EU/µg，可直接用于细胞转染，动物注射等。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| 无内毒素质粒中提试剂盒 | HSM010051-01 | 4T |
| HSM010051-02 | 25T |
产品组分
| 组分 | HSM010051-01 | HSM010051-02 | 主要组分 | 组分功能 |
| 包装次数 | 4 | 25 | / | / |
| RNase A | 100μL | 10mg | 核糖核酸酶A | 降解RNA |
| Buffer CL | 3mL | 15mL | NaOH | 激活柱子 |
| Buffer P1 | 15mL | 80mL | Tris/EDTA | 菌体重悬 |
| Buffer P2 | 15mL | 80mL | NaOH/SDS | 碱裂解 |
| Buffer LN3 | 10mL | 40mL | 醋酸钾/醋酸 | 中和液 |
| Buffer ER2 | 5mL | 25mL | 曲拉通 X-114 | 萃取除内毒素 |
| Buffer GWP | 10mL | 60mL | 胍盐 | 洗涤除RNA |
| Buffer EWB | 10mL | 60mL | 异丙醇/去毒剂 | 洗涤内毒素 |
| Buffer PW2 | 6mL | 25mL | 乙醇/Tris/NaCl | 洗涤除盐离子 |
| Elution Buffer （Endo Free） | 10mL | 60mL | 10mM Tris, pH8.5 | 洗脱液 |
| 纯化中柱 C6 | 4个 | 25个 | 玻璃纤维滤膜 | 吸附核酸 |
| 15mL收集管 | 4个 | 25个 | 收集管 | 收集滤液 |
准备事项
1. 加入~0.5mL BufferP1 至 RNase A 干粉中，吸打 5~10 次让 RNase A 干粉充分溶解，然后把RNaseA全部转移至BufferP1中，于2-8℃保存，有效期为 6 个月。
2. 按瓶子标签所示，加入 4 倍体积的无水乙醇稀释 BufferPW2，于室温保存。
实验流程（转染级质粒制备）
1. 初级培养：将含目的质粒的大肠杆菌菌种接种于含 1mL LB/抗生素培养基的 5-10mL培养管中，37℃摇床培养 6~8 小时进行小量扩增菌液。培养方法：在无菌条件下，用灭菌牙签挑取一单菌落，转移 1mL 含相应抗生素的 LB 培养基中，37℃摇床(200-300rpm)培养 6-8 小时。甘油保存菌种在保存过程中可能会丢失载体，先划平板进行活化，用灭菌牙签挑取一单菌落进行初步培养。
2. 扩 大培 养：在 250mL 培 养瓶 中 加 入50~75mL 含抗生素 LB 培养液，将 50μL 初级菌液至培养瓶中，37℃摇床培养 14~16 小时。培养瓶容量最好超过培养液体积的 4-5 倍，培养良好的菌液(LB 培养液)，OD600 应该在
2.0-3.0。2×YT 或 TB 培养液中菌体生长速度过快，不利于质粒充分复制，应尽量避免使用。使用 YT 或 TB 培养液时，按细菌生物量进行转换。高拷贝生物量为 200，若 YT/TB 培养液培养后，OD600=10，则高拷贝菌液量为 20mL。
3. 菌体收集：转移 50~75mL 培养液到适合的离心管中，4,000~5,000rpm 离心 15 分钟或8,000rpm 离心 3 分钟。纯化中柱 C6 最大结合力为 250µg，高拷贝载体只需用 50mL 菌液，超量 DNA 因无法吸附而随滤液流出。处理低拷贝载体，菌液用量可以达到 75mL，处理更多的菌液，需要按比例增加 Buffer P1，Buffer P2 和 Buffer LN3 的用量。
4. 菌体重悬：倒弃培养基，在吸水纸上轻轻拍 打 以 吸 尽 残 液， 加 入 3.0mL BufferP1/RNaseA 混合液至菌体中，高速涡旋重悬细菌。使用前确保 RNaseA 已加到 BufferP1 中。充分重悬细菌对产量很关键，重悬后应看不到明显的菌块。若涡旋未能充分打散菌块，用移液器吸打数次。未打散菌块会影响裂解而造成产量和纯度降低。
5. 菌体裂解：加入 3.0mLBufferP2，温和地上下颠倒混匀 8~10 次。室温静置 3 分钟，其间每隔 1 分钟温和地颠倒混匀 6-8 次。涡旋会造成基因组污染。混匀后溶液应变得粘稠而透亮。若溶液未能变得清亮，可能菌体过多而裂解不彻底，下次实验减少菌体用量或增加 BufferP1，BufferP2 和 BufferLN3 用量。当菌液用量达 75mL 时，裂解液会极为粘稠，属于高密度碱裂解类型，混匀时需要更多次数的颠倒和翻转动作，并轻稍振荡让菌体充分裂解，形成均一无团块裂解液，总裂解时间不要超过 5 分钟。
6. 菌体中和：加入 1.5mLBufferLN3 至裂解液，快速上下颠倒混匀 15~20 次直至形成蛋花状的悬浮液。加入 Buffer LN3 后应立即稍快速上下颠倒混匀，以避免产生局部沉淀。当菌液用量达75mL 时，属于高密度碱裂解类型，中和时会形成大块且紧密的沉淀团，混匀时需要更多次数的颠倒和翻转动作，并轻稍振荡让大块沉块团分散成蛋花状的团块，让 Buffer LN3 完全渗透到沉淀内部进行充分中和。
7. 去除杂质：4,000~12,000rpm 离心 15 分钟。这一步最好把中和液转移至耐高速离心管中，8,000~12,000rpm 进行离心以获得干净的上清液。若 4,000~5,000rpm 离心后，转移的上清液仍有明显杂质可重复离心步骤。若需更简单操作，可以订购中量过滤器进行过滤处理。
8. 去内毒素：转移上清液至新的离心管中，加入 0.1 倍体积 BufferER2，颠倒混匀。
9. 调整结合条件：加入 0.5 倍体积无水乙醇至样品中，颠倒混匀 8~10 次。无水乙醇体积=0.5×(上清液体积+Buffer ER2 的体积)。
10. 柱子激活：取纯化中柱 C6 套在 15mL 收集管中，加入 500μL BufferCL 至柱子中，静置 3 分钟，4,000~5,000rpm 离心 3 分钟。
11. 过柱纯化：倒弃滤液把柱子套回收集管，转 移 4mL 混 合 液( 第 9 步) 至 柱 子 中，4,000~5,000rpm 离心 3 分钟，重复这一步直至混合液都转移至柱子并离心。
12. 洗掉 RNA：倒弃滤液把柱子套回收集管，加入2mLBufferGWP至柱子中，静置2分钟，4,000~5,000rpm 离心 3 分钟。
13. 洗内毒素：倒弃滤液，把柱子套回收集管中。 加 入 2mL Buffer EWB 至 柱 子 中。4,000~5,000rpm 离心 3 分钟。
14. 脱盐：倒弃滤液，把柱子套回收集管中。加 入 4mL Buffer PW2 至 柱 子 中。4,000~5,000rpm 离心 10 分钟。
15. 干燥：取出纯化中柱 C6，打开盖子，室温放置 10 分钟晾干柱子。
16. 洗脱：把纯化中柱 C6 套在新的 15mL 离心管（自配）中，加入 0.5mLElutionBuffer至柱子膜中央。静置 3 分钟。4,000~5,000rpm离心 2 分钟。这一步可洗脱出 60~75% DNA，若需最高浓度，省略第 17 步的二次洗脱或两次洗脱分开。
17. 二次洗脱：再加入 0.3mLElutionBuffer至柱子膜中央。4,000~5,000rpm离心3 分钟。丢弃柱子，转移质粒溶液至新的 1.5mL 离心管中，转移至-20℃保存。
1）由于滤膜存在吸水且离心速度转低，约有
0.2mL 洗脱液损失，进行第二次洗脱能有效洗脱出余下的质粒 DNA。
2）这一步得到的质粒 DNA 可以直接用于细胞转染，但不建议用于动物注射或敏感细胞转染。附加流程用Buffer ER2 (Triton X-114)抽提可以进一步降低内毒素水平，可用于动物注射和高敏细胞转染。
附加步骤：双水相萃取进一步除内毒素
1. 取质粒 DNA 至 1.5mL 离心管中，补加灭菌水或 ELutionBuffer 至总体积为 900μL。
2. 然后加入 100μL Buffer LN3 和 100μLBufferER2 颠倒数次，冰上（或 2-8℃冰箱）放置 10~15 分钟，其间颠倒数次。42-55℃水浴 5 分钟。室温下，13,000rpm 离心 5min。水浴后，Buffer ER2 (Triton X-114)与内毒素结合在一起形成液泡结构不溶于水，在离心后在离心管底部分层成红色溶液层。
3. 转移上清液至新离心管中，加入 700μL 异丙醇至上清液中，颠倒混匀，静置 10 分钟。13,000rpm 离心 10min。
4. 小心倒弃上清液，加入 1.0mL75%乙醇，涡旋 5 秒，13,000rpm 离心 5min。
5. 小心倒弃上清液，再短暂离心，吸尽所有残液，空气干燥 5min。
6. 加入适量的 Elution Buffer 或灭菌水至沉淀中，涡旋混匀，室温放置 5-10min 让质粒充分溶解。
注意事项
本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
