试剂盒采用加厚滤膜柱式提取方法、以及整合了碱裂解方法、快速去内毒清洗液和 Triton X-114 双水相萃取内毒素方法，适合于从 10~15ml 培养过夜的大肠杆菌培养液中提取高达 100µg 低内毒素的转染级的质粒 DNA。纯化的质粒可直接用于细胞转染、测序、酶切、PCR、转化、文库筛选等应用。本产品对碱裂解进行了优化，可以在 25 分钟内完成数个样品提取工作。质粒产量纯度与宿主菌的种类、培养条件、拷贝数、质粒结构等因素相关。用于高敏细胞转染和动物注射时，我们建议用 Triton X-114 进行抽提以达到无内毒素级别。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| 无内毒素质粒小提试剂盒 | HSM010041-01 | 24T |
| HSM010041-02 | 100T |
产品组分
| 组分 | HSM010041-01 | HSM010041-02 | 主要组分 | 组分功能 |
| 包装次数 | 24次 | 100次 | / | / |
| BufferCL | 3ml | 11ml | NaOH | 激活柱子 |
| RNaseA | 100μL | 10mg | 核糖核酸酶A | 降解RNA |
| BufferP1 | 15ml | 60ml | Tris/EDTA | 菌体重悬 |
| BufferP2 | 15ml | 60ml | NaOH/SDS | 碱裂解 |
| BufferLN3 | 10ml | 30ml | 醋酸钾/醋酸 | 中和液 |
| BufferER2 | 5ml | 15ml | 曲拉通X-114 | 除内毒素 |
| BufferGWP | 15ml | 60ml | 盐酸胍 | 去除RNA |
| BufferPW2 | 6ml | 25ml | Tris/NaCl | 除盐离子 |
| Elution Buffer (EndoFree) | 10ml | 30ml | 10mM Tris, pH8.5 | 洗脱液 |
| 纯化小柱C6 | 24个 | 100个 | 玻璃纤维滤膜 | 吸附核酸 |
| 2ml收集管 | 24个 | 100个 | 收集管 | 收集滤液 |
准备事项
1. 加入 0.5ml BufferP1 至 RNaseA 干粉，吸打让 RNaseA 干粉溶解，然后全部转移至 BufferP1 中。若 RNaseA 是液体的，短暂离心后转移至 BufferP1 中，于 2-8℃保存，有效期为 6 个月。
2. 按瓶子标签所示，加入 4 倍体积的无水乙醇稀释 BufferPW2，于室温保存。
实验步骤（转染级）
1. 激活柱子：将纯化小柱 C6 装在收集管中，加入 100µl BufferBCL 至柱子滤膜上，静置 10~20 分钟，13,000×g 离心 1 分钟，倒弃滤液把柱子套回收集管备用。
2. 菌体收集：转移 10-15ml 培养过夜的大肠杆菌培养液（LB 培养基）到 15ml 离心管中，4,000~5,000×g 离心 10 分钟，倒弃培养液，反扣于吸水纸上拍打吸尽残液。
培养方法：在无菌条件下，用灭菌牙签挑取一单菌落，转移 10~15ml 含相应抗生素的 LB 培养基中，37℃摇床(200-300rpm)培养 14-16 小时。培养瓶容量最好超过培养液体积的 4-5 倍,平板挑菌培养时，可能会存在一些菌株生长缓慢。培养过夜后检测菌液密度或测量一下 OD600，培养良好的菌液(LB 培养液)，OD600 应该在 2.0-3.0。
2 xYT 或 TB 培养液因菌体密度很高，菌液用量不应超过 6ml。2 xYT 或 TB 培养液中菌体生长速度过快，不利于质粒充分复制，应尽量避免使用。
纯化柱 C6 最大结合力为 100µg,高拷贝载体只需要用 10ml 培养过夜的菌液，超量的 DNA 因无法吸附而随滤液流出。
3. 菌体重悬：加入500µl BufferP1/RNaseA，涡旋让菌体充分分散，转移至 2.0ml 离心管。
使用前确保 RNaseA 已加到 BufferP1 中。充分重悬细菌对产量很关键，重悬后应看不到明显的菌块。若涡旋未能充分打散菌块，用移液器吸打数次。未打散菌块会影响裂解而造成产量和纯度降低。
4. 菌体裂解：往重悬液中加入 500µl Buffer P2，上下翻转并转动离心管 15~20 次使菌体充分裂解，室温静置 3~5 分钟，其间上下翻转数次。
涡旋会造成基因组污染。混匀后溶液应变得粘稠而透亮。若溶液未能变得清亮，可能菌体过多而裂解不彻底，下次实验减少菌体用量或增加 BufferP1, BufferP2 和 BufferLN3 用量。
当菌液用量达 15ml 时，裂解液会极为粘稠，属于高密度碱裂解类型，混匀时需要更多次数的颠倒和翻转动作，并轻稍振荡让菌体充分裂解，形成均一无团块的裂解液，总裂解时间不要超过 5 分钟。
5. 菌体中和：加入 250µl Buffer LN3，立即稍快速上下颠倒或轻稍振荡混匀 15~30 次让溶液充分中和形成蛋花状悬液。
加入 Buffer LN3 后应立即稍快速上下颠倒混匀，以避免产生局部沉淀。当菌液用量达 15ml 时，属于高密度碱裂解类型，中和时会形成大块且紧密的沉淀团，混匀时需要更多次数的颠倒和翻转动作，并轻稍振荡让大块沉块团分散成较少的团块，让 Buffer LN3 完全渗透到沉淀内部。
6. 去除杂质：13,000xg 离心 10 分钟,转移上清液至新的离心管中。
若转移后的上清液含有明显沉淀物再离心一次。
7. 加入 0.1 倍体积 BufferER2 至上清液，颠倒混匀 6-8 次。
8. 可选,双水相萃取除内毒素：冰上（或 2-8℃冰箱）放置 10~15 分钟，45-55℃温育 5 分钟，室温 13,000xg 离心 10 分钟，小心转移上层上清液至新的离心管中。
常规细胞转染无需这一步处理。用于高敏细胞转染，建议进行这一步操作，低温下，Buffer ER2 与内毒素会高效结合在一起，温育时会形成液泡结构不溶于水，离心后会在管底分层形成红色溶液层，转移上清液不要吸到下层红色液相层。
9. 调整结合条件：加入 0.5 倍体积的无水乙醇至混合液（第 7 步）或上清液（第 8 步），颠倒混匀 8~10 次。
10. 过柱纯化：转移不超过 750µl 混合液至柱子(已激活)，13,000×g 离心 1 分钟，重复这一步把余下混合液移都转移至柱子再离心。
11. 洗掉 RNA：倒弃滤液把柱子套回收集管，加入 500µl BufferGWP，静置 2 分钟，13,000×g 离心 1 分钟。
12. 脱盐：倒弃滤液把柱子套回收集管,加入 500µl BufferPW2，13,000 ×g 离心 1 分钟。
13. 脱盐：倒弃滤液把柱子套回收集管,加入 500µl BufferPW2，13,000 ×g 离心 1 分钟。
14. 干燥：倒弃滤液把柱子套回收集管中，13,000xg 离心 2 分钟甩干柱子。
15. 洗脱：把柱子套在 1.5ml 离心管（自配）中，加入 80~150µl ElutionBuffer 至柱子,静置 3 分钟，13,000×g 离心 1 分钟洗脱 DNA。
弃去柱子，把质粒保存于-20℃。
这一步得到的质粒 DNA 可以直接用于细胞转染，但不建议用于动物注射或敏感细胞转染（省略步骤第 6 步）。附加流程用 BufferER2 (Triton X-114)抽提降低内毒素水平后，可以用于动物注射和高敏细胞转染。
附加步骤：无内质粒制备（0.1EU/µg）
1. 取质粒 DNA（第 15 步）至 1.5ml 离心管中，补加 ELutionBuffer 至总体积为 500µl。
2. 加入 50µl BufferLN3 和 50µl BufferER2，颠倒 10~15 次，冰上（或 2-8℃冰箱）放置 10~15 分钟，45~50℃温育 5 分钟沉淀内毒素形成浑浊液。
低温下，BufferER2 溶于水并与内毒素分子结合。超过 15℃时，Buffer ER2 和内毒素会形成液滴状液泡结构并不溶于水，可以通过离心去除。
3. 室温下，13,000xg 离心 10 分钟，转移上层上清液至新的离心管中。
离心后在管底形成红色液层，若离心后没有分层，再颠倒混匀，45~50℃温育 5 分钟，重复离心并确保离心机恢复至室温。
4. 加入0.7倍体积的异丙醇，颠倒混匀10次，室温放置 10 分钟，13,000xg 离心 10 分钟。
5. 小心倒弃上清液，加入 0.5ml 的 75%乙醇，涡旋 5 秒，13,000xg 离心 3 分钟。
6. 小心倒弃上清液，再短暂离心，吸尽所有残液，空气干燥 10min。
7. 加入 ELutionBuffer 至沉淀中，涡旋混匀，室温放置 5-10min 让质粒充分溶解。
注意事项
本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
