试剂盒采用柱式提取和改良碱裂解法相结合，适合于从 1~7mL 培养过夜的大肠杆菌培养液中提取高达 50µg 高纯度质粒 DNA。纯化的质粒可直接用于测序、酶切、PCR、转化、文库筛选，转染常规传代细胞等应用。本产品对碱裂解进行了优化，可以在 8 分钟内完成数个样品提取工作。质粒产量纯度与宿主菌的种类、培养条件、拷贝数、质粒结构等因素相关。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| 快速质粒小提试剂盒 | HSM010011-01 | 50T |
| HSM010011-02 | 200T |
产品组分
| 组分 | HSM010011-01 | HSM010011-02 | 主要组 分 | 组分功 能 |
| 包装次数 | 50次 | 200次 | / | / |
| RNaseA | 50μL | 200μL | 核糖核 | 降解 |
| Buffer | 3mL | 12mL | 酸酶A NaOH | RNA 激活柱 |
| BCL Buffer | 12mL | 45mL | Tris/ | 子 菌体重 |
| P1 Buffer P2 | 12mL | 45mL | EDTA NaOH | 悬 碱裂解 |
| Buffer BP3 | 22mL | 90mL | 盐酸胍/ 醋酸/异 | 结合液 |
| Buffer | 15mL | 60mL | 丙醇 盐酸胍/ | 除蛋白 |
| PWA Buffer PW2 | 6mL | 25mL | 异丙醇 Tris/ NaCl | 质 除盐离 子 |
| Elution Buffer | 10mL | 30mL | 10mM Tris, | 洗脱液 |
| 纯化柱 | 50 | 2×100 | pH8.5 玻璃纤 | 吸附核 |
| C3 2mL收 | 50 | 2×100 | 维滤膜 收集管 | 酸 收集滤 |
准备事项
(1) 短暂离心 RNaseA，把全部 RNase A 转移至 Buffer P1 中，2-8℃保存，有效期为 6个月。
(2) 按瓶子标签所示，加入 4 倍体积的无水乙醇稀释 BufferPW2，于室温保存。
(3) 纯化柱 C3 最高载量可达到 50µg，受湿气温度等贮藏条件影响，吸附柱最高结合力会下降，超过生产日期 6~8 个月或产量异常时，建议激活柱子以提高柱子最高载量，实验前将纯化柱 C3 装在收集管中，加入 50μL BufferBCL 至柱子滤膜上，静置 10~30 分钟。
(4) 低温下，Buffer P2 中的 SDS 会析出，使用前 37℃水浴使沉淀完全溶解。
实验流程
1. 菌体收集：13,000×g 离心 1 分钟，收集1~7mL 培养过夜的大肠杆菌培养液（LB 培养基），倒弃培养液，反扣于吸水纸上轻轻拍打吸尽残液。培养方法：在无菌条件下，用灭菌牙签挑取一单菌落，转移 1-7mL 含相应抗生素的 LB 培养液中，37℃摇床(200-300rpm)培养 12-14 小时。培养管或培养瓶容量最好超过培养液体积的 4-5 倍。2×YT 或 TB 培养液因菌体密度很高，菌液用量不应超过 2.5mL。2×YT 或 TB 培养液中菌体生长速度过快，不利于质粒充分复制，应尽量避免使用。纯化柱C3最大结合力为50µg,超量DNA因无法吸附而随滤液流出。处理低拷贝载体，菌液用 量 可 以 达 到 10~15mL， 扩 大BufferP1/P2/BP3 的体积。
2. 菌体重悬：加入 200μL BufferP1/RNaseA，高速涡旋让菌体充分分散。使用前确保 RNase A 已加到 BufferP1 中。充分重悬细菌对产量很关键，重悬后应看不到明显的菌块。若涡旋未能充分打散菌块，用移液器吸打数次。未能打散的菌块会影响裂解而造成产量和纯度降低。
3. 菌体裂解：往重悬液中加入 200μL BufferP2，温和上下翻转 6~8 次使菌体充分裂解。涡旋或振荡会造成基因组污染。混匀后溶液应变得粘稠而透亮。若菌体较多时室温放置 2~3分钟，其间再颠倒几次以充分裂解。若溶液未能变得清亮，可能菌体过多而裂解不彻底，下次实验减少菌体用量或增加 Buffer P1,BufferP2 和 BufferBP3 用量。
4. 菌体中和：加入 400μL BufferBP3，立即快速上下颠倒混匀 10~15 次让溶液中和。加入BufferBP3后应立即快速上下颠倒混匀，以避免产生局部沉淀。当菌体用量较多或过量时，增加混匀次数以充分中和。
5. （可选）去除杂质：13,000×g 离心 1 分钟。处理中高拷贝载体时可省略离心步骤，沉淀同试剂可以直接转移至柱子中，变性的基因组DNA 和蛋白离心后会在膜上形成致密的沉淀物，在第 10 步洗脱时不会被洗脱出来，不影响 DNA 的纯度和浓度。
6. 过柱纯化：将纯化柱 C3 装在收集管中，把上清液或混合液转移至柱子中，13,000×g 离心 1 分钟。生产日期超过 6 个月或产量异常时，建议加入50μL BufferBCL 激活柱子提高载量。
7. 除蛋白：倒弃滤液，把柱子套回收集管中。加入 250μL BufferPWA 至柱子中，13,000×g 离心 1 分钟。
8. 脱盐：倒弃滤液，把柱子套回收集管中。加入 500μL BufferPW2 至柱子中。13,000×g 离心 1 分钟。
9. 干燥：倒弃滤液，把柱子套回收集管中。13,000×g 离心 1 分钟甩干柱子。
10. 洗脱：把柱子套在 1.5mL 离心管（自配）中。加入 50~100μL ElutionBuffer 或灭菌水至柱子的膜中央。静置 1~2 分钟，13,000×g离心 1 分钟洗脱 DNA。弃去柱子，把质粒保存于-20℃。
OD 值测量和产量
（1）基座清洁：打开微量分光光度计，取 2μL ElutionBuffer 或灭菌水加到基座上，将样品臂放下，浸泡 2 分钟，用无尘布将检测基座擦拭干净。
（2）调零：基座清洁后，加入 2μL ElutionBuffer 进行调零后，用滤纸吸去液体。
（3）测量：混匀样品，取 2ul 待测样品进行测量，用滤纸吸尽液体，进行第二个样品测量，最后用灭菌水清洗完毕。
本产品得率的质粒 DNA：
A260/280 比值：本产品正常值为 1.80~1.95。若 A260/280 超过 2.0，说明存在 RNA 污染，请检查 P1/RNase A 有效期，或避免使用 2×YT 或 TB 等富含营养的培养液。
A260/230 比值：本产品正常值为 1.8~2.5。
电泳检测
（1）配制 0.8-1.0%琼脂糖凝胶，取 0.5-1µg质粒 DNA(约 0.5-3μL)进行电泳分析。电泳后有时会出现三条或甚至三条以上的 DNA 条带，有时会有两条，甚至只一条带的情况。这种情况与电泳上样量、培养时间、质粒结构都有关系。
（2）电泳后经典的三条 DNA 条带是指超螺旋、线性 DNA 和开环 DNA，其中超螺旋最快，含量越高越好。
常见问题
1. DNA 产量低
（1）质粒拷贝数:载体因拷贝数差异会造成质粒产量明显的波动。高拷贝数的载体常有 2~3倍的产量波动，(每毫升培养过夜的菌液，高拷贝数的质粒载体产量为 3~16µg)。长片段质粒(>7kb)和表达型载体常以中低拷贝数为主，每毫升菌液的产量约为 0.5~2µg。
（2）菌种问题：菌种保存过程中存在质粒丢失现象，养菌前最好先划线活化，以稳定产量。
（3）细胞未充分裂解：细菌须在 BufferP1/RNase A 中充分重悬，成团的细菌因无法裂解会降低产量。
（4）试剂准备有误：BufferP2 若有沉淀析出需加热溶解。
（5）长片段质粒（>10k bp）：处理长片段的质粒 DNA，建议使用质粒小提试剂盒(经典型)，或者将 BufferBP3 换成 BufferP3。
2. 基因组 DNA 污染
（1）培养时间太长：菌液培养时间需控制在12~16 小时。
（2）裂解问题：加入 Buffer P2 时，必须轻柔颠倒混匀；处理多个样品时，从加入 BufferP2 时算起，总时间不要超过 4 分钟。
3. 下游实验结果不理想
（1）质粒降解：用 end A+的菌株如 HB101或其它野生型菌株，含有高丰度的核酸酶，最好使用 HiPure PlasmidPlus Kits 系列。
（2）膜脱落:硅胶膜在离心过程中可能会发生脱落。脱落到质粒中硅胶膜是不溶解的。13,000×g离心2分钟后再把质粒转移至新的离心管中。
4. 中和后离心得不到上清
（1）盐析出：加入 Buffer BP3 中和后，不能低于 10℃离心。低温时，上清会有大量的盐析出而造成堵柱。若室内温度过低，可将BufferBP3 平衡至 37~50℃后使用。得到的上清要尽快过柱。
注意事项
本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
