HEK293残留DNA 检测试剂盒是用于定量检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中宿主细胞HEK293 DNA残留的试剂盒。本试剂盒利用 TaqMan荧光探针原理，定量检测样本中 HEK293残留 DNA。检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到fg水平。该试剂盒仅供研究使用，不可用于临床。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| HEK293残留DNA检测试剂盒（PCR-荧光探针法） | HBP003201-1 | 50T |
| HBP003201-2 | 100T |
产品组分
| 组分名称 | 50T | 100T | 储存条件 |
|---|---|---|---|
| qPCRReaction Buffer | 750 μL* 1 | 750 μL* 2 | -25℃~-15℃避光 |
| HEK293 Primer&Probe Mix | 250 μL* 1 | 250 μL* 2 | -25℃~-15℃避光 |
| HEK293DNA定量参考品 | 15 μL*1 | 30 μL*1 | -25℃~-15℃ |
| DNA稀释液 | 1.5mL*2 | 1.5mL*3 | -25℃~-15℃ |
运输与保存方法
-25℃~-15℃运输；-25℃~-15℃，避光保存。
有效期
规定存储条件下24个月。
适用机型
本产品适用但不限于以下仪器：7500Real-TimePCR System(ABI)，QuantStudio5（ABI），SLAN-96P Real-TimePCRsystem，qTOWER3G（德国耶拿）
实验所需自备材料
荧光定量 PCR 仪
1.5mL 无菌离心管
无菌无酶八联管或 96 孔 qPCR 板
1000 μL，200 μL，10 μL 无菌无酶低吸附带滤芯枪头
1000 μL，200 μL，10 μL 移液枪
实验流程
1.HEK293DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备
用试剂盒中提供的DNA稀释液将HEK293DNA定量参考品进行梯度稀释，稀释浓度依次为 3ng/μL、300pg/μL、30pg/μL、3pg/μL、300fg/μL、30fg/μL。具体操作如下：
（1）将试剂盒中的HEK293DNA定量参考品和 DNA稀释液置于冰上融化，待完全融化后，瞬时离心5s，涡旋混匀30s，瞬时离心10s，重复3次。
（2）取 6支干净的1.5mL离心管，分别标记为ST0， ST1，ST2，ST3，ST4，ST5。
（3）按照 Table1中稀释方法：ST0，ST1，ST2，ST3， ST4，ST5分别加入 90 μLDNA 稀释液。
（4）ST0管中加入10 μLHEK293DNA 定量参考品，涡旋混匀30s，瞬时离心10s。
（5）按照 Table1中顺序，依次稀释 ST1，ST2，ST3， ST4，ST5，每个梯度DNA 和稀释液混合后，均需要涡旋混匀30s，瞬时离心10s。 Table1.HEK293DNA 定量参考品稀释方法
| 稀释管 | 稀释体积 | 浓度 |
|---|---|---|
| ST0 | 10 μLDNA 定量参考品+90 μL DNA 稀释液 | 3ng/μL |
| ST1 | 10 μLST0+90 μLDNA 稀释液 | 300pg/μL |
| ST2 | 10 μLST1+90 μLDNA 稀释液 | 30pg/μ L |
| ST3 | 10 μLST2+90 μLDNA 稀释液 | 3pg/μL |
| ST4 | 10 μLST3+90 μLDNA 稀释液 | 300fg/μ L |
| ST5 | 10 μLST4+90 μLDNA 稀释液 | 30fg/μL |
▲ 已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于 2-8℃。
▲ 该标曲的线性范围为30fg/μl~300pg/μl，如需要，可扩大或缩小范围。
▲ 稀释后的 ST1可于-20 ℃保存6个月，ST2~ST5可于-20℃保存 1周。
▲ 每个梯度稀释时注意加样体积准确，涡旋振荡30s，瞬时离心10s，以确保模板充分混匀，呈现良好的线性关系。
2．加样回收质控 ERC的制备根据需要设置ERC中的 HEK293DNA 加样浓度（以制备加30pgHEK293DNA量的样品 ERC为例），具体操作如下：
（1）取200 μL待测样品加入到1.5mL离心管中。
（2）再加入10 μLST3，混匀，标记为样品ERC。样品ERC和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成样品ERC纯化液。
3. 阴性质控NCS的制备根据实验设置阴性质控，具体操作如下：
取200 μL样本基质溶液加入到1.5mL 离心管中标记为阴性质控NCS。阴性质控NCS和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。
4.qPCR反应液的制备和加样
（1）根据所需检测的标准样品和待测样品数量（一般做3组复孔），计算反应所需孔数：反应孔数=（5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1 个阴性质控NCS+待测样品×2）×3 ▲ 待测样品×2：因为推荐每个待测样品检测时同时做样品ERC。
（2）根据反应孔数计算本次所需的HEK293qPCRMix总量： HEK293qPCRMix=（反应孔数+2）×20 μL（含有 2孔的损失量）
（3）将所用试剂置于冰上融化，轻微振荡混匀，按下表所示配制HEK293qPCRMix。 Table2.HEK293qPCRMix 配置方法
| 组分 | 单个反应量 |
|---|---|
| qPCR Reaction Buffer | 15 μL |
| HEK293 Primer & Probe Mix | 5 μL |
（4）各试剂置于冰上融化，轻微振荡混匀，按下表所示加样（总体积30 μL）。 Table3. 各反应孔加样示例
| 样品 | 加样 |
|---|---|
| 标准曲线 | 20 μLHEK293qPCRMix+10 μL ST1/ST2/ST3/ST4/ST5 |
| NTC | 20 μLHEK293qPCRMix+10 μLDNA稀释液 |
| NCS | 20 μLHEK293qPCRMix+10 μLNCS纯化液 |
| 待测样品 | 20 μLHEK293qPCRMIX+10 μL待测样品纯化液 |
| 样品ERC | 20 μLHEK293qPCRMix+10 μL样品ERC纯化液 |
Table4.96孔板加样示例表
▲ 该示例表示检测5个浓度梯度HEK293DNA标准曲线（ST1～ST5）、1 个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、5个待测样品（S1～S5）和样品ERC（S1ERC～ S5ERC）。每个检测做3个重复孔。
▲ 实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行96孔板排版加样。
▲ 将反应孔板用PCR 盖子封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心10s后放入qPCR仪。
5.qPCR程序参数设置以 ABI 公司 QuantStudio5qPCR仪、软件版本1.5.1为例。
（1）创建空白新程序，Experimenttype：Standard Curve，Chemistry：TaqMan ® Reagents，Runmode： Standard。
（2）设置反应程序：
| 步骤 | 温度（℃） | 时间 | 循环数 |
|---|---|---|---|
| 预变性 | 95℃ | 10min | 1 |
| 变性 | 95℃ | 15s | 40 |
| 退火/延伸（收集荧光） | 60℃ | 1min |
（3）在Plate 界面，创建新检测探针，命名为HEK293-DNA，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为NFQ-MGB，检测参比荧光为ROX。
（4）在Plate 界面，将标准曲线孔Task 一栏设置为“ S ”，并且在 Quantity 一栏分别赋值为300、30、
3、0.3、0.03（含义为每孔的DNA 总量，单位为pg/μL），并且在相应的Samplename 一栏中命名为ST1、 ST2、ST3、ST4、ST5。
（5）在Plate 界面中，将无模板对照 NTC孔的 Task一栏设置为“N”，将待测样本孔的 Task一栏设置为“U”，并且在相应的 Samplename 一栏中命名样品的名称。
（6）设点击Run 界面”StartRun”进行 PCR测定。
6. 结果计算
（1）供试品结果计算按下式计算供试品的DNA 残留量：
（2）复孔变异系数的计算：
如DNA抽提样品检测结果在检测下限（ST6）附近（Ct值±2个循环）或检测结果 Ct大于ST6，不计算变异系数。加标供试品回收率的计算加标样品经过与样品同法处理后，根据PCR的标准曲线方程以及加标样品的Ct值，计算加标样品的DNA含量，根据加标的标示量，计算加标回收率。
注意事项
1. 使用化学药品时，一定要穿戴合适的实验服、一次性手套和护目镜。
2. 如试剂一次用不完，请放-20℃冰箱保存。
3. 如在操作过程中，不慎将试剂溅入眼口鼻，请立即用大量的清水冲洗。
4. 如果发现标签、试管壁出现污损、字迹不清楚等情况请停止使用该试剂盒。
