I-CeuI 是一种来源于衣滴虫（Chlamydomonas eugametos）的归位内切酶，经大肠杆菌重组表达纯化后获得。I-CeuI 特异性识别并切割 27 bp 非回文序列（5'-TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAA-3'），形成 4 bp 的 3'突出黏性末端。相较于 I-CeuI，I-CeuI 识别序列更长，其在基因组中自然出现的概率更低（约每 5.6×1017 个随机碱基出现一次），在基因编辑中特异性更高。
图标注释
最适反应温度为 37℃
失活条件为 80℃温育 20min
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 包装规格 |
|---|---|---|
| 归位内切酶 I-CeuI | HSM052001 | 250 U |
产品组分
| 组分 | 规格 |
|---|---|
| I-CeuI (5 U/μL) | 50 μL |
| pUC-HE (100 ng/μL) | 20 μL |
| 10×CutFlex Buffer | 1 mL |
| 10×CutFlex Color Buffer | 1 mL |
活性定义
1 活性单位（U）是指在 37℃条件下反应 1 h，酶切 1 μg pUC-HE 所需的酶量。
运输及保存方法
-25~-15℃运输与保存，有效期 2 年。
建议反应条件
1×CutFlex 缓冲液；37℃温育；参照“DNA 快速酶切流程”配制反应体系。
失活条件
80℃温育 20 min。
质量控制
功能活性检测：37℃下，在 20 μL 通用 CutFlex 反应体系中，1 μL I-CeuI 能够在 15 min 内完全消化 1 μg pUC-HE。
超长时间温育检测：37℃下，在 20 μL 通用 CutFlex 反应体系中，将 1 μL I-CeuI 与 1 μg pUC-HE 共同温育 3 h，未检测到其他核酸酶污染引起的底物非特异性降解。
酶切-连接-再酶切检测：37℃下，使用 10 倍酶量的 I-CeuI 消化 DNA 底物，回收酶切产物，在 22℃下使用 T4 DNA Ligase (Fast)可以将超过 95%的酶切产物重新连接。将连接产物再次回收后，使用相同的内切酶可以重新切开约 95%以上的连接产物。
使用方法
1. DNA 快速酶切流程
1) 在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系：
| 组分 | 质粒 DNA | PCR 产物 | 基因组 DNA |
|---|---|---|---|
| ddH2O | 15 μL | 16 μL | 30 μL |
| 10×CutFlex Buffer 或 10×CutFlex Color Buffer | 2 μL | 3 μLa | 5 μL |
| 底物 DNA | 2 μL (up to 1μg) | 10 mL (~0.2μg) | 10 μL (5μg) |
| I-CeuI (5 U/μL) | 1 μL | 1 μL | 5 μL |
| Total | 20 μL | 30 μL | 50 μL |
a.本体系适用于经过纯化的 PCR 产物酶切。未纯化的 PCR 产物具备一定的离子强度，10×CutFlex Buffer 加入量可适当减少至 2 μL。但由于 DNA 聚合酶同时具有外切酶活性，会影响酶切产物，因此如下一步需进行克隆等操作，建议酶切前对 PCR 产物进行纯化。
2) 轻柔吸打或轻弹管壁以混匀（切勿涡旋），然后瞬时离心以收集挂壁液滴；
3) 37℃温育 15 min（质粒），或 15~30 min（PCR 产物），或 30~60 min（基因组 DNA）；
4) 80℃温育 20 min 即可使酶失活，停止反应（可选）；
5) 如果使用 CutFlex Color Buffer 进行酶切反应，得到的产物可以直接进行上样电泳。
2. 适用于质粒的扩大反应体系
| 组分 | 体积 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| DNA | 1 μg | 2 μg | 3 μg | 4 μg | 5 μg |
| I-CeuI (5 U/μL) | 1 μL | 2 μL | 3 μL | 4 μL | 5 μL |
| 10×CutFlex Buffer or 10×CutFlex Color Buffer | 2 μL | 2 μL | 3 μL | 4 μL | 5 μL |
| Total | 20 μL | 20 μL | 30 μL | 40 μL | 50 μL |
注：如果总反应体系大于 20 μL，应适当增加温育时间，尽量使用水浴、金属浴或沙浴。
注意事项
1. 归位内切酶不具有限制性内切酶那样严格定义的识别序列。因此，单个碱基的改变并不影响其识别功能，但是会不同程度地降低酶切效率。识别序列中必需碱基的准确区域还不确定。列出的识别序列是已知可识别并酶切的位点。
2. 随酶提供对照质粒 DNA，浓度为 100 ng/μL。I-CeuI 酶切产生 2711 bp 的片段。pUC-HE 为氨苄抗性，可自行转化后大量提取用于其他实验。
不同 DNA 中的酶切位点数量
| DNA | 酶切位点数量 |
|---|---|
| λDNA | 0 |
| ΦX174 | 0 |
| pBR322 | 0 |
| pUC57 | 0 |
| pUC18/19 | 0 |
| SV40 | 0 |
| M13mp18/19 | 0 |
| Adeno2 | 0 |
甲基化修饰影响
| Dam | Dcm | CpG | EcoKI | EcoBI |
|---|---|---|---|---|
| 无影响 | 无影响 | 无影响 | 无影响 | 无影响 |
在不同反应缓冲液中的活性
| CutFlex Buffer | Thermo Scientific FastDigest Buffer | NEB rCutSmart™ Buffer | Takara QuickCut™ Buffer |
|---|---|---|---|
| 100% | 100% | 100% | 100% |
DNA 修饰酶在 Buffer 中的活性
| DNA 修饰酶 | Buffer | 活性 |
|---|---|---|
| T4 DNA Ligase（HSM060201） | 10×CutFlex Buffer | 100% |
| 10×CutFlex Color Buffer | 100% |
注：T4 DNA Ligase (Fast)需要 ATP 作为辅助因子。活性数据来自瀚海限制酶标准反应体系下的检测。
