HzyZoL Reagent 为单一相溶液，含异硫氰酸胍和酚。本产品是在酸性酚异硫氰酸胍 RNA 提取方案的基础上改良而成的(Piort Chemczychi,1987)。HzyZoL Reagent 可快速裂解细胞/组织，RNA 释放至溶液中，并可快速灭活核酸酶，保护 RNA 不降解。经过氯仿抽提后形成三相体系，其中 RNA 分布于水相层，DNA 和蛋白质分布于中间层和有机层，达到分离 RNA 的目的。HzyZoL Reagent 适合于从各种生物样品中快速提取高纯度的总 RNA。纯化的 RNA 可直接用于 RT-PCR、Northern 杂交、Poly(A)富集等下游应用。此外，HzyZoL Reagent 还可以用于 DNA 和蛋白质的提取等。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| HzyZoL Reagent-TrizoL Reagent替代品 | HSM010101-01 | 50mL |
| HSM010101-02 | 200mL |
准备工作
1. 氯仿
2. 异丙醇
3. 70%乙醇(DEPC 处理水配制)
4. DEPC 处理水或 RNaseFree Water
5. RNase-Free 的 1.5mL 离心管和枪头
6. 匀浆工具
7. 低温高速离心机(12,000×g)
8. HzyZoL Reagent 的用量与组织的关系。
| 样品类型 | 样品用量 | HzyZoL Reagent用量 |
| 组织样品 | <10mg | 0.8mL+100µg Glycogen |
| 10-100mg | 1mL | |
| 贴壁细胞 | 培养面积 10cm2 | 1mL |
| 悬浮细胞 | 102-105细胞* | 0.8mL+100µg Glycogen |
| 5-10×106细胞 | 1mL | |
| 全血 | 100µL | 1mL |
注：样本的体积不能超过 HzyZoL Reagent 体积的 10%。细胞提指动物、酵母、植物细胞。Glycogen 需另外购买，使用时，请用 DEPC 配制成 20mg/mL。样品在 HzyZoL Reagent 中充分匀浆后，可在 4℃保存 3 天，-80~-20℃保存六个月以上。
实验流程
1. 按下列方法对样品进行匀浆：
(1) 动物组织：称取 10-100mg 动物组织到离心管中，加入 1mL HzyZoL Reagent，立即用研磨杵或匀浆器进行充分匀浆。动物组织样品也可以用液氮研磨(参照植物处理方法)。
(2) 植物组织：用液氮将植物样品磨成粉末状，称取 30-100mg 样品至离心管中，立即加入1mL HzyZoL Reagent，涡旋充分打散样品。
(3) 贴壁细胞：彻底去除培养液，对 10cm 2培养面积，加入 1mL HzyZoL Reagent，移液枪吸打 3-5 次，让细胞充分裂解。
(4) 悬浮细胞：500×g 离心收集细胞(<1×10 7细胞)，去除培养液。涡旋或用手指弹打松散细胞团。加入 1mL HzyZoL Reagent，移液枪吸打 3-5 次让细胞充分裂解。
(5) 细菌：离心收集(1×108 细菌)，加入 100µLTE/lysozyme 处理 10 分钟，然后加入 1mLHzyZoLReagent，涡旋 1 分钟。
(6) 微量真菌：转移<50mg 真菌样品至 2mL真菌/细菌匀浆管中，加入 1mL HzyZoLReagent，高速涡旋 5-10 分钟裂解真菌。
2. 室温放置 3~5 分钟。
3. (可选) 4℃，12,000×g 离心 10 分钟。转移上清液至新的离心管中。处理富含蛋白质或难裂解的组织样本时，匀浆后仍可能存不溶解的物质。离心去除这些杂质有利于提高纯度。富含脂肪的样本，离心后还会在溶液表面存在一层油脂层，转移上清液时尽量不要吸取到油脂。
4. 按 1mL HzyZoL Reagent 加入 200µL 氯仿或 100µL BCP 至裂解液中。用手剧烈振荡 15 秒，室温放置 3 分钟。用涡旋取代振荡会带来更多的基因组 DNA 污染。振荡必须快速的，缓慢颠倒会造成抽提不充分，氯仿须按比例加入，过多的氯仿会逼使 DNA和蛋白质回到水相中，导致 RNA 的纯度下降。由于氯仿挥发性强，毒性较大，可用 100µLBCP(1-Bromo-3 chloropropane)代替。若样品含有丰富的 DNA，按 1mL HzyZoLReaget加入 5µL 冰醋酸混匀后，再加入氯仿进行抽提。
5. 4℃，12,000×g 离心 15 分钟。离心后会形成三相体系。上层为水相层含有RNA，而 DNA 和蛋白质位于有机层(下层)和中间层。中间层的多少取决于样本类型，有些样品的中间层较少。
6. 小心转移上清液(~500µL)至新的1.5mL离心管中。加入等倍体积异丙醇，颠倒或涡旋混匀，室温静置 10 分钟。DNA 位于有机相和中间层。吸取上清液时，粘稠的基因组有可能会被吸到上清液中，轻柔的操作和转移少量上清液有利于减少 DNA 污染。加入异丙醇后，可在 4℃沉淀过夜，-20℃或-70℃低温沉淀可能会引起盐析出，应尽量避免。由于异硫氰酸胍对 RNA 有一定的损伤作用，不建议长期放置。处理富含蛋白质(如肝脏等)的样品时，用无水乙醇代替异丙醇可以提高 RNA 的纯度。
7. 4℃，12,000×g 离心 10 分钟沉淀 RNA。
8. 倒弃上清液。加入 1mL75%乙醇。涡旋或颠倒混匀。若 RNA 需要长期保存，最好在这一步中保存。加入 75%乙醇后，RNA 可在 4℃保存一个月，或-20℃保存一年以上。
9. 4℃，7,500×g 离心 5 分钟。
10. 倒弃上清液，把离心管反扣于干净的吸水纸上吸弃残留的液体。空气干燥 10-15 分钟。倒弃上清液后，若管壁上仍残留较多的液体，短暂离心收集管壁上的液滴，用 10-100µL 的枪头吸弃残液，再空气干燥 5-10 分钟。空气干燥时间过长会导致 RNA 很难溶解。
11. 加入适量的缓冲液、100%甲酰胺、DEPC处理水、或无核酸酶的水至 RNA 沉淀中。涡旋重悬RNA沉淀。冰上放置10-30分钟让RNA充分溶解。若需要长时间保存 RNA，请用 100%甲酰胺溶解 RNA。若 RNA 比较难于溶解，可 50℃水浴10-15 分钟以加速 RNA 的溶解。溶解液的加入量取决于样品的用量，类型和所需的浓度。
下游分析
1. OD 测量涡旋 RNA 样品，吸取 1-2µL RNA，用 10mMTris, pH7.4 稀释 20-100 倍，于紫外分光光度计测量 230nm(盐)、260nm(核酸)、280nm(蛋白)和 320nm(不溶物或背景)的吸光值。
•RNA 浓度(ng/µL)= OD260×40×稀释倍度；
• RNA的理想的纯度：OD260/OD280=1.9-2.1，OD260/OD230 =1.8-2.5；
•若 320nm 有较高的读数，则 OD230、OD260 和 OD280 必须都减去 OD320nm 后，再进行计算。
2. 电泳分析取 0.5-1µg RNA 上样于 1.0%琼脂糖凝胶，5V/cm 电泳 15-30 分钟。常规琼脂糖凝胶电泳时，RNA 上样量最好不要超过 1µg。
3. DNA 污染的去除
HzyZoL Reagent 可去除 95%DNA 污染。多数应用，如 Northern 杂交，Poly (A)富集等无需处理。由于 PCR 敏感高，对单拷贝数的基因都可能被扩增，若纯化的 RNA 用于RT-PCR，建议使用 DNase 消化，才能彻底去除 DNA 的污染。
常见问题
1. 处理不同组织时，RNA 的产量如何？
| 组织类型 | 每mg样本RNA产量 |
| 肝脏、脾脏 | 6-10µg |
| 肾脏 | 3-4µg |
| 肌肉、脑组织 | 1-1.5µg |
| 胎盘 | 1-4µg |
| 肺组织 | 1.5-2µg |
2. 提取的 RNA 产量低或降解了？
（1）RNA 过于干燥，或 RNA 还没有完成溶解；
（2）样品匀浆不够充分，或匀浆时间过长，导致溶液升温而引起 RNA 的降解；
（3）操作过程中引起 RNase 污染；
（4）样 品 贮 藏 条 件 不 正 确， 建 议 使 用RNASaferReagent 来保存固体组织样品。
3. DNA 的污染
（1）上清液转移得太多；
（2）HzyZoL Reagent 的用量与组织用量关系不对；
（3）匀浆不彻底，裂解液太粘稠；
（4）样品中含有丰富的基因组 DNA，样品在HzyZoL Reagent 裂 解 匀 浆 后， 按 1mLHzyZoLReagent 加入 5µL 冰醋酸，然后再加入氯仿抽提；
（5）加入氯仿时没有剧烈振荡，或采用涡旋代替振荡；
（6）氯仿过量加入；
（7）进行 RT-PCR 时，建议使用 DNase I 消化去除残留的 DNA。
4. 纯度低(OD260/OD280<1.65)
（1）HzyZoL Reagent 的用量与组织用量关系不对；
（2）加入氯仿时没有剧烈振荡，或采用涡旋代替振荡；
（3）氯仿过量加入或有酚的残留；
（4）裂解不够充分，匀浆后须室温放置 5 分钟；
（5）处理富含蛋白的样品如肝脏，用无水乙醇代替异丙醇，即在第 6 步加入等倍体积无水乙醇来沉淀 RNA；
（6）减少样品用量；
（7）建议使用 HiPure Universal RNA Kit 提取样品的 RNA，可明显提高纯度。
注意事项
本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
