本产品是一款专为小鼠基因型快速鉴定设计的试剂盒，包含DNA粗提取及PCR扩增体系。本产品可直接利用小鼠尾巴、耳朵、脚趾等组织经 Lysis Buffer、Proteinase K 简单裂解处理后进行 PCR 扩增，无需过夜消化、酚氯仿抽提或柱式纯化等操作，使用简便，极大缩短实验耗时。产品适用于 2 kb 以内目的片段的扩增以及 3 对引物以内的多重 PCR 反应。本产品所提供的 2×Mouse Tissue Direct PCR Mix 中，包含经过基因工程改造的 DNA 聚合酶、Mg2+、dNTPs 及优化的缓冲体系，具有极高的扩增效率和抑制物耐受度，使用时只需加入模板和引物，并补水至 1×即可进行 PCR 反应，使用本产品扩增的 PCR 产物 3′端带有一个突出的“A”碱基，纯化后可直接用于 TA 克隆。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| 鼠尾（动物）组织直接扩增试剂盒 | HSM020011 | 5×1mL |
产品组分
| 组分 | 规格 |
|---|---|
| 2×Mouse Tissue Direct PCR Mix | 5×1.0 mL |
| Lysis Buffer | 2×20 mL |
| Proteinase K | 800 μL |
产品特点
（1）操作简便：无需提取基因组 DNA；
（2）适用广泛：适用于多种小鼠组织的直接扩增。
适用范围
本产品适用于小鼠基因敲除分析、转基因检测、基因分型等。
实验流程
1. 基因组 DNA 的释放
（1）裂解液配制：根据需要裂解的小鼠样品数量配制组织裂解液（组织裂解液应现用现配，且充分混匀后使用），单个样品所需试剂比例如下：
| 组分 | 推荐用量 |
|---|---|
| Lysis Buffer | 200 μL |
| Proteinase K | 4 μL |
（2）样品准备与裂解
推荐组织使用量：
| 组织类型 | 推荐用量 |
|---|---|
| 小鼠尾尖 | 1~3mm |
| 小鼠耳朵 | 2~5mm |
| 小鼠脚趾 | 1~2个 |
取适量小鼠组织样品于干净的离心管中，向每个离心管中加入 200 μL 新鲜的组织裂解液，涡旋震荡后在 55℃下孵育 30min，然后 98℃加热处理 3min。
（3）离心：
将裂解产物充分震荡混匀，12,000 rpm 离心 5min，上清液可作为模板直接用于 PCR 扩增。模板如需保存，可将上清液转移至另一个无菌离心管中，并置于-20℃保存，保存时间为 2 周。
2. PCR 扩增
将 2×Mouse Tissue Direct PCR Mix 从-20℃取出后置于冰上解冻，上下颠倒混匀后按下表配制 PCR 反应体系（冰上操作）：
| 组分 | 25 μL体系 | 50 μL体系 | 终浓度 |
|---|---|---|---|
| 2×Mouse Tissue Direct PCR Mix | 12.5 μL | 25 μL | 1× |
| Primer 1（10 μM） | 1.0 μL | 2.0 μL | 0.4 μM |
| Primer 2（10 μM） | 1.0 μL | 2.0 μL | 0.4 μM |
| 裂解产物* | As require | As require | |
| ddH2O | Up to 25 μL | Up to 50 μL |
*加入量不应超过体系的 1/10，加入量过高时可能会抑制 PCR 扩增。
建议的 PCR 条件
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
|---|---|---|---|
| 预变性 | 94℃ | 5min | 1 |
| 变性 | 94℃ | 30s | 35~40 cycles |
| 退火* | Tm+3~5℃ | 30s | |
| 延伸 | 72℃ | 30s/kb | |
| 终延伸 | 72℃ | 5min | 1 |
| - | 4℃ | Hold | - |
*退火温度：参考引物 Tm 值，建议退火温度设置为引物中 Tm 较小值+3~5℃。
常见问题与解决方法
1. 无目的条带
（1）裂解产物过量。选择最合适的模板用量，一般不超过体系的 1/10；
（2）取样量过大。将裂解产物稀释 10 倍后扩增，或减少取样量重新裂解；
（3）组织样品不新鲜。建议使用新鲜的组织样品；
（4）引物质量差。使用基因组 DNA 进行扩增验证引物质量，优化引物设计。
2. 出现非特异扩增
（1）退火温度过低、循环数过高。提高退火温度，减少循环数；
（2）模板浓度太高。减少模板用量或将模板稀释 10 倍后扩增；
（3）引物特异性差。优化引物设计。
注意事项
1. 为了避免样品间出现交叉污染，需准备多个取样工具，如需反复使用可在每次取样后用 2%次氯酸钠溶液或核酸清洁剂对工具表面进行清洁；
2. 建议使用新鲜采取的小鼠组织，取样量不宜过大，以避免影响扩增结果；
3. Lysis Buffer 应避免反复冻融，短期内多次使用可置于 2~8℃保存。若低温保存可能会出现沉淀，在使用前务必充分溶解；
4. PCR Mix 应避免反复冻融，短期内多次使用可置于 4℃保存；
本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
