加帽率是 mRNA 的疫苗的关键质量属性，因为在 mRNA 的 5'端需要有帽结构以保护mRNA 分子免受降解，并促进蛋白质翻译。 mRNA 加帽率检测样品前处理试剂盒，可对待检测加帽率的 mRNA 样品进行高效、可重现的处理以便进行 5’端序列的 LC-MS 分析。该试剂盒包含预配制的 4×RNase H Mix、链霉亲和素磁珠和优化的方案，可在 1.5 小时内准备完成质谱待上机样品。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| mRNA 加帽率检测样品前处理试剂盒 | HBP005001 | 10T |
| HBP005002 | 50T |
运输与保存方法
0℃以下运输；链霉亲和素磁珠与洗涤液于2~8℃储存，其余于-25~-15℃储存。
产品组分
| 组分 | HBP005001 | HBP005002 |
|---|---|---|
| 4×RNaseHMix | 250 μL | 5*250 μL |
| 链霉亲和素磁珠 | 500 μL | 5*500 μL |
| 洗涤液 | 8mL | 5*8mL |
| 洗脱液 | 300 μL | 5*300 μL |
| 阳性对照mRNA(1μg/μL) | 200 μL | 5*200 μL |
| 阳性对照探针(10μM) | 100 μL | 5*100 μL |
自备材料
耗材：无核酸酶 200μLPCR 管、1.5mL 离心管、20μL 和 200μL 枪头。试剂：探针、无核酸酶水。
操作流程
1.探针设计与合成：
本试剂盒不含有特异性探针，需要根据待测mRNA 的 5’端目的序列设计一段与之反向互补的 14-30nt 探针，靠近 5’端或探针中间含有 4-6 个 DNA 碱基，其余位置为 2’-O-甲基修饰的 RNA 碱基，3’端携带 Biotin TEG 标记，如图 1 所示。合成的干粉探针离心后用无核酸酶水溶解稀释至 10μM 备用。
2.待测 mRNA 样本与探针用量计算：
待测 mRNA 摩尔质量（g/mol）=mRNA 长度（X nt）×330 100pmol 待测 mRNA 添加量（μL）=0.0001 ×mRNA 摩尔质量（g/mol）/mRNA 浓度（μ g/μL）探针用量：2倍待测mRNA摩尔数（200pmol）探针添加量（μL）=200pmol÷探针浓度（10 μM）阳性对照 mRNA 长度为 997 nt，浓度为 1μg/μL，代入公式计算后 100mol 添加量为 32.9 μL,四舍五入后添加量为 33μL。
3.酶切反应取出
4×RNase HMix 与探针在冰上融化。在200μL 无核酸酶 PCR 管中，在室温下按以下顺序依次添加组分进行体系配制。
| 组分 | 体积 |
|---|---|
| 无核酸酶水 | Upto100 μL |
| 4×RNaseHMix | 25 μL |
| 待测mRNA 样本 | X μL(100pmol) |
| 10μM 探针 | 20 μL |
溶液配制完成，涡旋混匀，瞬时离心于管底，将 PCR 管置于 PCR 仪中，50℃反应 15min。
4.纯化回收
4.1 准备磁珠：取出置于 2~8℃储存的链霉亲和素磁珠，吹打混匀后，吸取 50μL 磁珠于
1.5mL 无核酸酶离心管中，放置在磁力架上静置 3min，待溶液澄清，用移液器移除上清液。
4.2 磁珠清洗：离心管从磁力架移开，加入 200 μL 洗涤液，吹打混匀，置于磁力架上，待溶液澄清，用移液器移除上清液。重复清洗 1次。
4.3 样本与磁珠结合：离心管从磁力架移开，将酶切反应液加入离心管中，吹打混匀后置于100-150rpm 水平摇床室温振荡 30min（间隔15min 可将离心管上下颠倒混匀，防止磁珠沉积在离心管底部）。反应结束后，瞬时离心，放置在磁力架静置 3min，待溶液澄清，用移液器移除上清液。
4.4 洗杂：离心管从磁力架移开，加入 200μL洗涤液，吹打混匀，置于磁力架上，待溶液澄清，用移液器移除上清液。重复清洗 1 次。加入 200μL 预冷的无核酸酶水，吹打混匀，置于磁力架上，待溶液澄清，用移液器移除上清液。重复清洗 1 次。
4.5 洗脱：离心管从磁力架移开，加入 30μl洗脱液，吹打混匀，将离心管置于金属浴或恒温箱中 80℃3min，室温静置 5min，置于磁力架静置，将上清液转移至新离心管中，置于磁力架静置，将上清液转移至 LC-MS 进样瓶中，确保无磁珠转入。
注意事项
• 转录反应配制应在无核酸酶污染的环境中完成，操作过程建议佩戴手套、使用无核酸酶的水、枪头和反应管进行体系配制；
• 请勿冷冻、干燥或离心链霉亲和素磁珠。冷冻、干燥或离心会导致磁珠聚集并失去结合活性。
• 若检测无信号，将待测 mRNA 体系用量增加到 200pmol，对应反应体系等比例放大。
• 本试剂盒内含有的阳性对照 mRNA 为共转录加帽 mRNA，经过阳性对照探针在试剂盒体系酶切纯化后，理论酶切产物为：5’ -m7GpppmAGGAAAUAAGAGAGAAAA-3’，对应理论分子量为 6453.92Da。
• 本试剂盒仅供科研或生产使用，不可直接应用于人体。
