足够长度的 poly（A）尾是维持 mRNA 稳定性和翻译效率所必需的，因此，poly（A）尾长度是 mRNA 疫苗的关键质量属性。mRNA poly（A）尾长度检测样品前处理试剂盒，可对待检测 poly（A）尾长度的 mRNA 样品进行高效、可重现的处理以便进行 3’端序列的LC-MS 分析。该试剂盒包含预配制的 10× Rnase T1Mix、洗涤液、洗脱液和填料，可在1 小时内准备完成样本制备。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| mRNA poly (A) 尾长度检测样品前处理试剂盒 | HBP005009 | 10T |
| HBP005010 | 50T |
运输与保存方法
0℃以下运输；填料于 2-8℃储存，空心离心柱于室温储存，10×RNase T1 Mix、洗涤液和洗脱液和阳性对照mRNA于-25~-15℃储存。
产品组分
| 组分 | HBP005009 | HBP005010 |
|---|---|---|
| 10×RNaseT1Mix | 200 μL | 5*200 μL |
| 阳性对照mRNA (1μg/μL) | 100 μL | 5*100 μL |
| 洗涤液 1 | 9×1mL | 45*1mL |
| 洗涤液 2 | 1mL | 5*1mL |
| 洗脱液 | 1mL | 5*1mL |
| 填料 | 200 μL | 5*200 μL |
| 空心离心柱 | 10 个 | 5*10 个 |
自备材料
耗材：无核酸酶 1.5mL 离心管、20μL 和 200 μL 枪头。试剂：无核酸酶水。
操作流程
1.待测 mRNA 样本用量计算：
待测 mRNA 摩尔质量（g/mol）=mRNA 长度（X nt）×330 100pmol 待测 mRNA 添加量（μL）=0.0001 ×mRNA 摩尔质量（g/mol）/mRNA 浓度（μ g/μL）
2.酶切反应
室温下按照下表进行体系配制。
| 组分 | 体积 |
|---|---|
| 无核酸酶水 | Upto200 μL |
| 10×RNaseT1Mix | 20 μL |
| 待测mRNA 样本 | X μL(100pmol) |
溶液配制完成，涡旋混匀，瞬时离心，95℃反应 15min。
3.纯化回收
3.1 准备填料：取出 2-8℃储存的填料，充分混匀后，吸取 20μL 填料于 2mL 空心离心柱中，掌上离心机离心 15s,弃滤液。
3.2 清洗填料：吸取 200μL 洗涤液 1 于 3.1 的2mL 空心离心柱中，涡旋振荡器振荡 5s 或上下颠倒混匀 5-10 次，掌上离心机离心 15s,弃滤液。重复清洗 1 次。
3.3 样本与填料结合：将酶切反应液加入 3.2的空心离心柱中，涡旋振荡器振荡 5s 或上下颠倒混匀 5-10 次，室温放置 5min。
3.4 洗杂：将 3.3 的空心离心柱于掌上离心机离心 15s,弃滤液。吸取 200μL 洗涤液 1 加入到空心离心柱，涡旋振荡器振荡 5s 或上下颠倒混匀 5-10 次，掌上离心机离心 15s,弃滤液。重复清洗 1 次。吸取 50μL 的洗涤液 2 再加入到空心离心柱中，涡旋振荡器振荡 5s 或上下颠倒混匀 5-10 次，掌上离心机离心 15s,弃滤液 （洗涤液 2 的体积至关重要，按照建议量加入，既不能多加，也不能少加）。
3.5 洗脱：取出 3.4 的空心离心柱内管于新的离心管中，加入 50μL 洗脱液，涡旋振荡器振荡 5s 或上下颠倒混匀 5-10 次，掌上离心机离心 15s，收集滤液，将其转移至 LC-MS 进样瓶中待用。
注意事项
• 酶切反应配制应在无核酸酶污染的环境中完成，操作过程建议佩戴手套、使用无核酸酶的水、枪头和反应管进行体系配制；
• 请勿冷冻填料。
• 洗涤液 2 的体积至关重要，既不能多加，也不能少加。
• 若检测信号低，将待测 mRNA 体系用量增加到 200pmol，其它组分不变。
• 在进行 3.4 洗杂加入 50ul 洗涤液 2 及 3.5加入 50ul 洗脱液时，会使很多填料溶液附着在管壁上，属正常现象，尽量上下混匀即可。
• 本试剂盒内含有的阳性对照 mRNA 的 poly（A）尾长度分布经质谱检测为 30A 和 70A。
• 本试剂盒仅供科研或生产使用，不可直接应用于人体。
• 阳性对照反应体系
| 组分 | 体积 |
|---|---|
| 无核酸酶水 | 147 μL |
| 10×RNaseT1Mix | 20 μL |
| 阳性对照mRNA 样本 | 33 μL(100pmol) |
