核酸酶残留活性检测试剂盒基于荧光基团标记的探针，当样本中不含核酸酶活性时，该探针稳定存在，不会产生荧光信号；当样本中含有核酸酶活性时，探针被降解，产生逐渐增强的荧光信号。荧光探针的信号值与核酸酶的数量和活性成正相关，使用带荧光检测的酶标仪在 Ex/Em=485/525nm 波长下测定荧光信号值，以判断样本中的核酸酶残留活性。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| 核酸酶残留活性检测试剂盒(荧光探针法) | HBP000112-1 | 48T |
| HBP000112-2 | 192T |
运输及保存方法
1、试剂盒于-25~-15℃运输，避免强光直射，有效期 12 个月。
2、收到试剂盒后，DNase RNase 清除剂置于2~30℃储存，其余组分-25~-15℃储存。
3、开封后试剂盒储存 6 个月，探针建议根据单次使用量进行分装后避光储存。
产品组分
| 名称 | HBP000112-1 | HBP000112-2 |
|---|---|---|
| 10×反应液 | 0.5mL | 2.0mL |
| 荧光探针 | 1管 | 1管 |
| TE缓冲液 | 0.5mL | 2.0mL |
| 核酸酶标准品 | 10μL | 20μL |
| 标准品稀释液 | 6mL | 12mL |
| 无DNase无RNase水 | 25mL | 25mL |
| DNaseRNase清除剂 | 50mL | 50mL |
注：核酸酶标准品根据瓶标的单位酶活使用。
所需仪器和试剂
荧光酶标仪(含 Ex/Em=485/525nm 波长)无 DNase 无 RNase 移液器与吸头无 DNase 无 RNase 离心管无 DNase 无 RNase 黑色不透明底 96 孔板
实验前准备
1、将试剂盒取出平衡至室温(18~25℃)，10 ×反应液、TE 缓冲液、核酸酶标准品、标准品稀释液使用前充分振荡混匀，然后瞬时离心(4000~7000rpm 离心 10 秒)。
2、将荧光探针 4000~7000rpm 离心 60 秒，使粉末聚集至管底，小心开启管盖后加入 40 μL TE 缓冲液溶解为荧光探针储存液。根据单次使用量进行分装后于-25~-15℃储存，避免反复冻融。每次实验使用前取出荧光探针储存液，稀释 50 倍(如 10μL 荧光探针储存液加入490μLTE 缓冲液)作为荧光探针工作液。
检测步骤
1、首次实验前需调节酶标仪合适的增益值，以避免信号过低和过饱和的风险：
（1）设置仪器参数：温度 37℃/终点模式/检测前振板 10~15s/激发波长 Ex=485nm，发射波长 Em=525nm。
注：若仪器有自动增益选项，则选用自动增益。若没有自动增益选项，则根据增益值范围设置中间值(不同仪器设置方法不一致，具体咨询仪器供应商)。
（2）在 96 孔板上选择 2 孔, 每孔加入 10μL荧光探针工作溶液和 10μL 10×反应液。其中1 孔加入 80μL 无 DNase 无 RNase 水，另外1 孔加入 79μL 无 DNase 无 RNase 水+1μL核酸酶标准品。
（3）37℃避光放置 30min 后检测。
（4）选用自动增益时，在数据文件中的仪器参数栏会显示增益值(Gain)，记为 G1。选用增益值范围中间值时，若加标准品孔的荧光值超过仪器上限，则适当降低增益值；若加标准品孔的荧光值远低于仪器下限，则适当提高增益值。最终得到合适的增益值，记为 G2。
2、检测仪器参数：温度 37℃/检测前振板10~15s/ 激发波长 Ex=485nm/ 发射波长Em=525nm。增益值设定为检测步骤 1 中自动增益得到的 G1 或调节过的增益值 G2。
注：若酶标仪支持动力学检测，推荐采用动力学检测模式，1~1.5min间隔，总时间30min。
3、样品准备
（1）推荐待测样本检测体积为 80μL，若样本体积不足 80μL，使用无 DNase 无 RNase 水补足至 80μL。
（2）若待测样本中含有影响荧光基团发光的物质(如深色溶液，高浓度的黏性物质或表面活性剂)，使用无 DNase 无 RNase 水稀释样本，但稀释操作会影响检测灵敏度。
（3）若待测样本中含核酸酶活性抑制剂(如高离子强度溶液、pH<4 或 pH>9 的缓冲液、蛋白变性剂等)，则测定结果为样本溶液的整体酶活性，而不是样本溶液中酶的单独活性。
定性检测
1、核酸酶标准品使用标准品稀释液按下表进行稀释：
| 编号 | 配制过程 | 终浓度 |
|---|---|---|
| 1 | 根据标准品瓶标酶活使用标准品稀释液稀释至100U/uL | 100U/μL |
| 2 | 2μL 编号1样本+198μL标准品稀释液 | 1U/μL |
| 3 | 2μL 编号2样本+198μL标准品稀释液 | 1×10 -2 U/μL |
| 4 | 20μL 编号3样本+180μL标准品稀释液 | 1×10 -3 U/μL |
| 5 | 20μL 编号4样本+180μL标准品稀释液 | 1×10 -4 U/μL |
| 6 | 20μL 编号5样本+180μL无DNase无RNase 水 | 1×10 -5 U/μL |
编号6样本作为阳性对照，无DNase无RNase水作为阴性对照。
2、加样及检测
（1）96 孔板每孔加入 10μL 荧光探针工作液和 10μL 10×反应液。
（2）分别加入 80μL 的阴性对照、阳性对照、待测样本，每个样本 2 个复孔。
（3）立即测试读取 0min 荧光信号值 RFU0，
（4）37℃避光放置 30min 后，读取 30min荧光信号值 RFU30。若采用动力学模式，则可读取 0~30min 所有荧光信号。
检测结果的解释
阳性对照需 RFU30≥2×RFU0，阴性对照需RFU30<2×RFU0。若样本的 RFU30≥2× RFU0，则待测样本中有核酸酶残留。
注：若待测样本严重污染或含有干扰物质时，可能会出现RFU0(待测样本)＞RFU0(阳性质控)，且RFU30(待测样本)＜2×RFU0(待测样本)，导致假阴性判断。此时应将待测样本使用无DNase无RNase水进行稀释后进行检测。
定量检测
1、核酸酶标准品使用标准品稀释液按下表进行稀释：
| 编号 | 配制过程 | 浓度 |
|---|---|---|
| 1 | 根据标准品瓶标酶活使用标准品稀释液稀释至100U/uL | 100U/μL |
| 2 | 2μL 编号1样本+198μL标准品稀释液 | 1U/μL |
| 3 | 2μL 编号2样本+198μL标准品稀释液 | 1×10 -2 U/μL |
| 4 | 20μL 编号3样本+180μL标准品稀释液 | 1×10 -3 U/μL |
| 5 | 40μL 编号4样本+360μL无DNase无RNase水 | 1×10 -4 U/μL |
| 6 | 200μL编号5样本+200μL无DNase无RNase水 | 5.0×10 -5 U/μL |
| 7 | 200μL编号6样本+200μL无DNase无RNase水 | 2.5×10 -5 U/μL |
| 8 | 200μL编号7样本+200μL无DNase无RNase水 | 1.25×10 -5 U/μL |
| 9 | 200μL编号8样本+200μL无DNase无RNase水 | 0.625×10 -5 U/μL |
| 10 | 无DNase无RNase水 | 0U/uL |
编号 5-10 样本作为标准品。
2、加样及检测
（1）96 孔板每孔加入 10μL 荧光探针工作液和 10μL 10×反应液。
（2）分别加入 80μL 的阴性对照、阳性对照、待测样本，每个样本 2 个复孔。
（3）立即测试读取 0min 荧光信号值 RFU0，
（4）37℃避光放置 30min 后，读取 30min荧光信号值 RFU30。若采用动力学模式，则可读取 0~30min 所有荧光信号。
检测结果的解释
将标准品和待测样本按检测步骤同时检测，得到初始荧光值 RFU0 和反应后荧光值 RFU30。计算∆RFU=RFU30-RFU0，以∆RFU 为纵坐标，核酸酶标准品浓度为横坐标，进行线性拟合，拟合方程 y=ax+b，相关性系数 r2≥0.99，将∆RFU(待测样本)作为 y 带入方程，求出 x，乘以样本稀释倍数后，为待测样本的活力值。
注：因仪器信号波动，可能会出现∆RFU＜0的情况，此时按∆RFU=0计算。
检测性能
1、检出限：全能核酸酶：1.00x 10 -5 U/μL。
2、精密度：批内变异系数≤10%，批间变异系数≤15%。
注意事项
1、加样操作应尽量快，时间过长会影响实验准确性。
2、不同荧光酶标仪的参数不一样，首次测试前需调节合适的增益值。
3、所有试剂使用前应充分摇匀，加样时应将所加样物加入酶标板孔中底部，避免加在孔壁上部，加样时注意不可溅出，不可产生气泡。
4、试剂盒中标准品为全能核酸酶，其活性单位定义为：在 37°C，pH 8.0 条件下，在30min 内使△A260 的吸收值变化 1.0（相当于完全消化 37μg 剪切鲑鱼精 DNA 成为寡核苷酸）所用的酶量定义为一个活性单位（U）。
5、为避免外源核酸酶污染，可使用 DNase RNase 清除剂喷洒于实验台面、手套等表面， 5 分钟后用洁净纸巾擦拭干净即可进行后续的实验操作。
