One Step RT-PCR Master Mix (Dye Plus) 是以 RNA 为模板进行检测的一步法 RT-PCR 试剂盒。本试剂盒经过优化，实现逆转录酶、DNA 聚合酶、缓冲液一管式操作，升级后的逆转录酶、DNA 聚合酶搭配，提高了试剂的特异性、扩增产量和灵敏度。试剂包含红色示踪染料，在反应结束后可直接点样电泳，方便快捷；试剂盒配备了 5× gDNA Wiper 组分，进一步纯化 RNA 样本，扩增结果更加真实可靠。One Step RT-PCR Master Mix (Dye Plus) 可检测低至 0.1 pg 的总 RNA，稳定检出长达 10 kb 片段，兼容多重扩增体系，保障 RT-PCR 反应的高产量和高灵敏度。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
| One Step RT-PCR Master Mix（Dye Plus） | HMD3918-01 | 50 rxn（50 μL/rxn） |
产品组分
| 组分 | 货号 | 规格 |
| 5x gDNA Wiper Mix | HMD3918-A-01 | 200 μL |
| 2x One Step RT-PCR Master Mix (Dye Plus) | HMD3918-B-01 | 1.25 mL |
注意事项
•本产品适用于动物、植物、微生物（病毒等）的各种 RNA 类核酸检测
•操作过程中请使用 RNase free 耗材，防止 RNase 污染
•吸取反应液时应尽量避免气泡，进行上机时请检查 PCR 管管盖是否盖紧以避免液体蒸发导致的结果不准确及扩增产物污染
•样本前处理应在生物安全柜进行，实验过程中使用的吸头应直接打到 10%次氯酸废液缸中
•试剂使用前请充分融化混匀，不同批号试剂不宜混合使用
反应体系
若需去除 RNA 模板中基因组 DNA，可在 RNase-free 离心管中配制如下反应液：
| 组分 | 体积 |
| 模板 RNA | 0.1 pg-1 μg |
| 5x gDNA Wiper Mix | 4 μL |
| 无核酸酶水 | Up to 20 μL |
用移液器轻轻吹打混匀或短暂涡旋后离心，42℃ 2 min
•切勿将该组分和引物提前预混
•若无需去除基因组 DNA，可直接省略该步骤，直接配置 RT-PCR 反应体系
RT-PCR 反应体系
| 组分 | 体积 |
| 2x One Step RT-PCR Master Mix (Dye Plus) | 25 μL |
| Primer Forward (10 µM) | 2 μL |
| Primer Reverse (10 µM) | 2 μL |
| 模板 RNAa | 1 pg-1 μg |
| 无核酸酶水 | Up to 50 μLb |
a: 消化后的模板，最多可添加 20 µL。
b: 可根据实验需要调整反应体积，各组分用量只需等比例调整即可。
反应程序
标准程序
1. 目的片段 <5 kb
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 逆转录 | 55℃ | 30 min | 1 Cycle |
| 预变性 | 94℃ | 3 min | 1 Cycle |
| 变性 | 94℃ | 30 s | 30-35 Cycles |
| 退火 | 60℃ | 30 s | |
| 延伸 | 72℃ | 0.5-1 min/Kb | |
| 彻底延伸 | 72℃ | 5 min | 1 Cycle |
2. 目的片段 >5 kb
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 逆转录 | 55℃ | 30 min | 1 Cycle |
| 预变性 | 94℃ | 3 min | 1 Cycle |
| 变性 | 94℃ | 30 s | 30-35 Cycles |
| 延伸 | 68℃ | 1 min/Kb | |
| 彻底延伸 | 72℃ | 5 min | 1 Cycle |
•退火温度推荐设置在 50℃~60℃范围内，一般设置成低于引物退火温度 5℃即可；对于 >5 kb 的片段，推荐使用长引物，Tm 值在 68℃~70℃，把退火/延伸温度合并为 68℃，这样可以显著提高扩增特异性。
•对于 <5 kb 的片段，延伸时间最少设置为 0.5 min/kb；对于 >5 kb 的片段，延伸时间最少设置为 1 min/kb。一般来说，延伸时间的延长有利于提高扩增产量。
•循环数可根据实际情况调整，基因表达量较低或模板浓度偏低时，可适当增加循环数，提高扩增产量。
快速程序
目的片段 <5 kb
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 逆转录 | 55℃ | 5 min | 1 Cycle |
| 预变性 | 94℃ | 3 min | 1 Cycle |
| 变性 | 94℃ | 15 s | 30-35 Cycles |
| 退火 | 60℃ | 30 s | |
| 延伸 | 72℃ | 30 s/Kb | |
| 彻底延伸 | 72℃ | 5min | 1 Cycle |
